CD20單抗對 Burkitt淋巴瘤細胞 Bcl-2和 p38MAPK蛋白表達的影響

秦文嬌,顧靜文,許小平,陳 潔,陳波斌,林果為

淋巴瘤是血液系統常見的腫瘤之一。靶向治療藥物聯合細胞毒藥物是目前淋巴瘤治療的熱點。其中 CD20單抗 (Mebthera,Rituximab,利妥昔單抗,美羅華)已經在臨床有較多應用[1],它通過多種作用方式誘導淋巴瘤細胞凋亡,如抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用 (ADCC)和補體依賴的細胞溶解作用 (CDC)。有文獻推測 CD20單抗也可能直接誘導 B淋巴細胞凋亡,但具體機制目前尚不清楚。Bcl-2基因 (B-cell lymphoma/Leukemia gene,B細胞淋巴瘤/白血病 -2基因)是凋亡因子的信號轉導途徑的調節點,其表達產物可抑制 B淋巴細胞凋亡的發生。80%低度惡性和 30%中度惡性淋巴瘤 Bcl-2基因有 t(14∶18)染色體移位,從而導致 Bcl-2蛋白的過表達。Bcl-2過表達的淋巴細胞是日后復發的根源,而且可導致對多種化療藥物的耐藥。臨床研究顯示抗 Bcl-2藥物可以增加 CD20單抗的療效,兩種藥物有協同作用。CD20單抗的應用,是否也會影響 Bcl-2蛋白通路的表達,從而引起細胞凋亡的改變,目前尚未有詳細的實驗室研究的報道。CD20有多個磷酸化位點,包括細胞內主要的信號轉導系統之一——絲裂素活化的蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases,MAPK)。p38 MAPK信號轉導通路可在許多腫瘤細胞凋亡中發揮作用,其活性增加可保護 B淋巴細胞免于凋亡。但是這一通路是否受 CD20單抗的調節,目前亦尚無文獻報道。因此,本研究通過觀察不同濃度 CD20單抗對 B淋巴細增殖的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Raji和 Namalwa淋巴瘤細胞株均來自于中國科學院細胞庫。培養于 RPMI 1640培養基至對數生長期。

1.2 細胞活力測定 將 Raji和 Namalwa細胞株加入終濃度為12.5μmol/L、25.0μmol/L和 50.0μmol/L的 CD20單抗中,以 PBS作為空白對照藥物作用不同時間 (12、24、48、72 h);棄上清,加入 MTT 20 l培養 4 h;加二甲亞砜 100μl,于 490 nm波長處測定吸光度值,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率 (%)=(1-CD20單抗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.3 流式細胞儀檢測凋亡指標 Annexin V+和 PI-細胞為早期凋亡細胞,Annexin V+和 PI+細胞為晚期凋亡細胞。將 50.0 μmol/L CD20單抗加入實驗組,以空白 PBS為對照組。獲取細胞懸液,離心,PBS清洗 3次;加入 AnnexinⅤ -FITC及碘化丙啶 (PI)混勻反應后用流式細胞儀檢測,雙標記法采集紅色熒光和綠色熒光,CELLQUEST軟件分析,以散點圖 (dot plot)形式打印。

1.4 目的蛋白的免疫印跡鑒定 吸棄細胞培養上清,PBS洗滌后加入 200μl的 M-PERTM試劑,將細胞裂解液離心,吸取清亮上清液 (細胞蛋白質)50.0μg/ml進行 SDS-PAGE,電轉移 1.5 h分離后電轉移至 NC膜,密封置搖床 1 h,放入用封閉液稀釋的鼠抗人 Bcl-2、p38單克隆抗體液 (終濃度20μg/ml)孵育 1 h,TTBS緩沖液洗膜,移入羊抗鼠 IgG-HRP二抗中孵育;洗膜后 DAB顯色系統檢測。以 β-actin作為內參,目的蛋白含量 =目的蛋白灰度值/同一樣本 β-actin灰度值。

1.5 統計學方法 數據以 (x±s)表示,兩組間數據比較用t檢驗,統計分析在 SPSS 10.0統計軟件上完成,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD20單抗對淋巴瘤細胞增殖的影響 不同終濃度的CD20單抗分別作用于 Raji細胞 12、24、48和 72 h后的細胞抑制率:12.5μmol/L時分別為 (5.80±0.29)%、(16.28±0.78)%、 (20.05±1.42)%和 (19.41±0.71)%;25.0 μmol/L時分別為 (19.06±0.75)%、 (30.39±0.26)%、(40.40±0.99)%和 (39.34±1.20)%;50.0μmol/L時分別為 (38.50±1.70)%、 (52.31±1.62)%、 (71.91±2.05)%和 (50.42±2.16)%。對同一終濃度、不同處理時間及相同處理時間、不同終濃度的細胞增殖抑制率進行每兩組間統計分析,表明:不同終濃度的 CD20單抗作用 12、24和 48 h時細胞增殖抑制率間差別有統計學意義 (P＜0.05,見圖 1)。同樣不同終濃度的 CD20單抗對 Namalwa細胞也有相似的抑制結果。

2.2 CD20單抗誘導淋巴瘤細胞株凋亡 Raji細胞株實驗結果:實驗組細胞凋亡率為 (31.52±2.48)%,對照組為(2.03±0.94)%,差異有統計學意義 (P＜0.05,見圖 2)。Namalwa細胞株實驗結果:實驗組細胞凋亡率為 (21.84±1.69)%,對照組為 (1.49±0.87)%,差異有統計學意義 (P＜0.05,見圖 3)。

2.3 目的蛋白的檢測結果 使用50.0μmol/L的 CD20單抗處理 48 h后,2株細胞株中的 Bcl-2和 p38MAPK蛋白的表達量與對照組的表達量比較,差異均有統計學意義 (P＜0.05,見表 1、圖 4)。

圖 1 CD20單抗對細胞增殖抑制率的影響Figure 1 The growth rate after Rituximab treatment

圖 2 Raji細胞凋亡率Figur e 2 The apoptosis rate of Raji cell

圖 3 Namalwa細胞凋亡率Figure 3 The apoptosis rate of Namalwa cell

表 1 CD20單抗對 Bcl-2和 p38MAPK蛋白表達的影響 (x±s)Table 1 The effect of Rituximab on Bcl-2 and p 38MAPK protein expression of Raji and Namalwa lymphoma cell

圖 4 CD20單抗對 Bcl-2和p 38MAPK蛋白表達的影響Figur e 4 The effect of Rituximab on Bcl-2and p 38MAPK protein expression of Raji and Namalwa lymphoma cell by Western blot

3 討論

淋巴瘤的靶向治療因其特異性殺傷靶細胞、不損傷正常組織細胞的特點,臨床應用日益廣泛。CD20單抗是其代表藥物,可通過 ADCC和 CDC誘導 B淋巴瘤細胞凋亡,其誘導 CD20陽性的 B淋巴瘤細胞直接凋亡的作用及機制越來越受到關注。

為了明確 CD20單抗抑制淋巴瘤細胞增殖的效果,選擇最佳的藥物作用濃度,本實驗使用不同濃度 CD20單抗分別處理Raji細胞株 12、24、48和 72 h后測定細胞抑制率。結果顯示與對照組相比,實驗組 Raji細胞株的細胞抑制率明顯增加,以 50.0μmol/L濃度處理 48 h后的效果最佳,可達到 (71.91±2.05)%?？梢娫谝欢ǚ秶鷥?CD20單抗對 Raji細胞的增殖有明顯的抑制作用,且呈劑量 -效應和時間 -效應依賴關系。

流式細胞術檢測 50μmol/LCD20單抗處理 48 h的 Raji和Nawalma細胞的凋亡率,實驗組細胞比對照組明顯增多,確切證實體外單獨使用 CD20單抗,未通過抗體和補體介導的細胞毒作用,仍可以直接誘導細胞的凋亡,這是 CD20單抗殺傷淋巴瘤細胞的又一效應機制。

用 Western blot檢測 Raji和 Namalwa細胞株 Bcl-2和p38MAPK蛋白的表達,結果表明:在 CD20單抗處理后的 Raji和 Namalwa細胞株中,Bcl-2和 p38MAPK蛋白的表達量與對照組相比均有明顯下降。

Bcl-2基因是一種原癌基因,具有抑制凋亡的作用,可以調節各種信號轉導途徑的共同交叉點。Bcl-2過度表達可增強細胞對大多數 DNA損傷因子的抵抗性,抑制大多數化療藥物所引起的靶細胞凋亡[2]。p38MAPK在體內細胞信號轉導中起協調作用,參與 B淋巴細胞凋亡的調控,有文獻認為p38MAPK激活后對 B淋巴細胞有保護作用,可以拮抗細胞毒藥物[3-4]。本研究前一步已證實 CD20單抗可以直接誘導CD20(+)的 B淋巴瘤細胞的凋亡,因此結合本實驗結果推測其正是通過減少 Bcl-2及 p38MAPK蛋白的表達,阻止了這兩個蛋白調控的抗凋亡通路的信號轉導,誘導細胞的凋亡。結合臨床資料[5],抑制 Bcl-2的表達的藥物可以誘導細胞凋亡,增強 CD20單抗的作用,與其有協同作用,也說明 Bcl-2蛋白表達減少可能是 CD20單抗發揮作用的途徑之一。

1 Mclaughlin P,Grillo-Lopez AJ,Link BK,et al.Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma:half of patients respond to a four-dose treatment program[J].Clinical Oncology,1998,16(8):2825-2833.

2 Zhou J,Zhang S,Shen HM.Critical role of pro-apoptotic Bcl-2 family members in an drugrapholide-induced apoptosis in human cancer cells[J].Biochemical pharmacology,2006,72:132-144.

3 Vega MI,Huerta-Yepaz S,Garban H,et al.Rituximab inhibits p38 MAPK activity in B NHL and decreases IL-10 transcription:Pivotal role of p38 MAPK in drug resistance[J].Oncogene,2004,23(20):3530-3540.

4 Aaron L,Miller M,Webb S,et al.p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK)is a key mediator in glucocorticoid-Induced apoptosis of lymphoid cells:correlation between p38 MAPK activation and sitespecific phosphorylation of the human glucocorticoid receptor at serine 211[J].Mol Endocrinol,2005,19(6):1569-1583.

5 Jeyanthi R,Francisco J,Hernandez-Ilizaliturr,et al.Pro-apoptotic therapy with the oligonucleotide genasense(oblimersen sodium)targeting Bcl-2 protein expression enhances the biological anti-tumour activity of rituximab[J].British Journal of Haematology,127:519-530.