上矢狀竇閉塞后水通道蛋白 -4表達與血 -腦脊液屏障破壞的關系

張忠玲,李國忠,陳旭輝,尹燕紅,宋 宇,趙秀麗

腦靜脈竇閉塞后會引起靜脈壓力升高,細胞間液和腦脊液之間的平衡失調,導致嚴重威脅患者生命的腦水腫,尤其早期表現為血 -腦脊液屏障 (blood-brain barrier,BBB)破壞引起的血管源性腦水腫,臨床缺乏有效的治療方法。近年來研究發現,廣泛分布于星形膠質細胞軸突的水通道蛋白 -4(aquaporin 4,AQP-4)介導水分子的跨膜轉運,在腦梗死及腦出血后 AQP-4表達顯著增高,參與血管源性腦水腫的形成[1]。而關于腦靜脈閉塞的研究少見報道。本研究旨在探討大鼠上矢狀竇閉塞后 AQP-4在 BBB破壞中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型 選擇健康雄性 Wistar大鼠 49只,體質量 250～300 g(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物實驗中心提供)。采用隨機數字表將大鼠隨機分為對照組和實驗組,實驗組又根據不同閉塞時間 3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d分為 6組,每組 7只,正常飲食 (哈醫大一院動物實驗中心提供)平衡 1周。參照 Schaller等[2]報道的方法,大鼠腹腔內注射 10%水合氯醛 (350 mg/kg體質量)全麻醉后,固定于立體定向儀上,在無菌條件下行額頂部開顱,骨窗為 0.5 cm×0.5 cm,暴露上矢狀竇,在顯微鏡下沿上矢狀竇后段兩側切開硬膜約 0.3 cm,使上矢狀竇后段游離,用絲線貫穿后在近竇匯 0.1 cm處結扎上矢狀竇后段,術后縫合皮膚,放回籠內,自由喂養。按不同閉塞時間處死大鼠,如實驗3 h組于結扎上矢狀竇后 3 h處死大鼠,其余各組依次類推。對照組 (假手術組)只暴露、游離上矢狀竇,絲線貫穿留置而不結扎。

1.2 腦組織含水量的測定 取各組大鼠 7只,處死后取腦,各組動物取相同部位額部皮質 150 mg,稱濕重 (精確到 0.1 mg)后立即放入恒溫電烤箱內,溫度設置為 100℃,時間為24 h,然后稱取干重,用 Blliot公式:腦含水量 =(濕重 -干重)/濕重 ×100%,計算腦組織含水量。

1.3 BBB通透性測定 各組大鼠處死前 1 h尾靜脈注入 1.5%伊文氏藍 (Evan blue,EB)2 ml/kg,麻醉后心內灌注 0.9%氯化鈉溶液 200～250 ml,斷頭取腦,放置于 5 ml甲酰胺中孵育 24 h,收集上清液,用 756分光光度計 (620 nm)測得吸光度,依照 EB/甲酰胺標準品計算出腦組織 EB含量 (μg/g)。1.4 免疫組化檢測 AQP-4蛋白的表達 取各組大鼠 7只,0.9%氯化鈉溶液經主動脈灌流沖洗血液,再用 4%多聚甲醛200 ml灌注固定,取腦放入 20%蔗糖 PBS液中 4℃過夜脫水,次日,將標本置于恒冷冰凍切片機行冠狀連續切片,片厚 6 μm,冰凍切片經 H2O2處理 10 min后,用 10%正常羊血清封閉 30 min,一抗 (濃度為 1∶250)為兔抗大鼠 AQP-4單克隆抗體 (武漢 Boster生物技術公司),室溫下孵育過夜,ABC試劑盒 (北京中山公司)按說明書進行操作,DAB顯色系統閉光顯色后光鏡觀察,AQP-4蛋白陽性細胞為神經元胞質內有棕黃色沉淀物,計數每平方毫米中陽性細胞數。

1.5 統計學方法 采用 SPSS 10.0統計軟件進行統計學處理。計量資料以 (x±s)表示,采用 t檢驗和相關性分析,以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦組織含水量及 EB含量的比較 腦組織含水量在上矢狀竇閉塞 6 h開始增加,持續升高 3 d達到高峰,后逐漸回落,實驗 6 h、12 h、24 h、3 d、7 d組與對照組比較,差異均有統計學意義 (P＜0.05)。與對照組相比,實驗組腦組織EB含量在 6 h、12 h、24 h、3 d時明顯升高,差異均有統計學意義 (P＜0.05),24 h時 EB含量達到高峰 (見表 1)。

2.2 各組 AQP-4表達情況的比較 對照組相同部位可見AQP-4表達呈弱陽性,上矢狀竇閉塞后各時相點水腫腦組織均有不同程度 AQP-4陽性表達細胞。AQP-4表達在上矢狀竇閉塞后 6 h開始上調,24 h達高峰,維持 3 d時開始逐漸回落,除 3 h外,實驗組各時相點相同部位 AQP-4的表達與對照組比較,差異均有統計學意義 (P＜0.05,見表 1)。

2.3 AQP-4表達與腦組織含水量的相關性分析表明,兩者呈正相關 (r=0.846,P＜0.01)。

表 1 對照組與實驗組大鼠腦組織含水量和 EB含量及 AQP-4表達情況比較 (x±s)Table 1 Comparison of brain water content,concentration of EB,AQP-4 expression between control group and test groups

3 討論

腦水腫是腦靜脈竇閉塞后最主要的病理變化,腦靜脈竇閉塞后腦水腫的形成是一個十分復雜的過程,目前的研究還遠不能清楚地闡明。血管源性腦水腫是由于 BBB開放或破壞、血管通透性增加導致血漿蛋白、水分和電解質等向血管外滲出引起的細胞間質水腫,是腦靜脈竇閉塞后早期的病理生理特征[3]。以往研究發現,AQP-4在與毛細血管和軟腦膜直接接觸的神經膠質細胞及血管周圍表達豐富,這些分布特點表明AQP-4是 BBB水調節和運輸的重要結構,與 BBB的通透性有密切關系[4]。

本研究結果顯示,上矢狀竇閉塞后 3 h腦組織含水量即有增加的趨勢,實驗6 h組與對照組比較有差異,而代表 BBB損傷的 EB含量與 AQP-4表達的增加均在上矢狀竇閉塞后 6 h,這提示上矢狀竇閉塞后極早期 (6 h以內)腦組織含水量的增加可能與 AQP-4表達及 BBB的改變無關,而是由于靜脈側支通路的開放,靜脈壓升高,腦脊液回流受阻,導致顱內壓升高,從而引起腦組織含水量的增加,是一種流體靜力性腦水腫。上矢狀竇閉塞后 24 h,EB含量與 AQP-4表達達到最高峰,腦組織含水量也明顯增加,說明 AQP-4的增高與 BBB的破壞有直接關系,是血管源性腦水腫形成的關鍵機制。相關性分析表明 AQP-4表達與腦組織含水量呈正相關。但是,上矢狀竇閉塞后腦組織含水量在第 3 d達到高峰,與 AQP-4表達的高峰并不一致,說明還有其他的機制參與腦水腫的形成,我們推測隨著上矢狀竇閉塞時間的延長,動脈血流減慢,局部腦血流量減少,腦組織缺血、缺氧,能量代謝衰竭,細胞膜破壞,離子和水分子進入細胞內,導致細胞毒性腦水腫,使腦水腫進一步加重,這符合腦靜脈梗死的病理生理特點,即早期出現血管源性腦水腫,隨后出現細胞毒性腦水腫[3]。

由此可見,AQP-4增高是 BBB的破壞及血管源性腦水腫的重要因素,抑制 AQP-4的表達將達到緩解腦水腫的目的。有研究發現,腦缺血再灌注后,激活的蛋白激酶 C(PKC)可以使 AQP-4磷酸化,磷酸化后的 AQP-4生物活性喪失,從而減輕腦水腫,但是 PKC的激活也可以直接引起 BBB的通透性增加,加重腦水腫[5],因此推測,機體可能存在一套調節AQP-4與 PKC之間平衡的機制,有必要進一步深入研究。總之,本研究結果提示,上矢狀竇閉塞后 AQP-4表達增高是 BBB破壞的原因之一,如果能在早期抑制 AQP-4的表達,可能會保護 BBB和減輕血管源性腦水腫。

1 Badaut J,Lasbennes F,Magistretti PJ,et al.Aquaporins in brain:distribution,physiology,and pathophysiology[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22:367-378.

2 Schaller B,Graf R,Sanada Y,et al.Hemodynamic changesafter occlusion of the posterior superior sagittal sinus:an experimental PET-study in rat[J].AJNR,2003,24:1876-1880.

3 Rottger C,Trittmacher S,Gerriets T,et al.Reversible MR imaging abnormalities following cerebral venous thrombosis[J].Am J Neuroradiol,2005,26:607-613.

4 唐宇平,蔡定芳,劉軍,等 .急性腦出血血腫周圍組織水通道蛋白 -4表達與血腦屏障損傷的關系 [J].中華神經科雜志,2005,38(11):704-707.

5 Verkman AS,Binder DK,Bloch O,et al.Three distinct roles of aquaporin-4 in brain function revealed by knockout mice[J].Biochim Biophys Acta,2006,1758:1085-1093.