桿菌肽的生物法檢測及發酵條件研究

周 欣 ，張 麗 ，李雄飛

（1.保定職業技術學院，河北 保定 071000；2河北農業大學，河北 保定 071001；3北京正大集團，北京 101301）

桿菌肽是由地衣芽孢桿菌或枯草桿菌變種的培養液分離而得。桿菌肽對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，抗菌譜與青霉素G相似，主要用于治療耐青霉素的葡萄球菌感染，還可用作飼料添加劑。[1]。目前桿菌肽的工業生產主要通過微生物發酵法制得，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是目前廣泛應用的工業生產菌種。我國的桿菌肽發酵生產始于20世紀60年代，隨著我國畜牧養殖業的興起，于上個世紀90年代開始大量生產桿菌肽，以芽孢桿菌為菌種，玉米和豆粕為主要原料，通過生物發酵、鋅絡合制備而成[2]。試驗對桿菌肽的生物法檢測和發酵條件進行了研究。

1 材料

（1）菌株：地衣芽孢桿菌，本實驗室保存。

（2）主要培養基：營養肉湯培養液、營養肉湯固體培養基；發酵培養液：丙三醇15 g，谷氨酸0.5 g，磷酸鈉14.3 g，硫酸鎂0.025g，蒸餾水 1000mL，pH7.5。

（3）主要儀器：低速離心機（北京醫用離心機廠），全溫振蕩培養箱（哈爾濱東聯電子技術開發有限公司制造），PHS－3C數字酸度計，光學顯微鏡（OLYMPUS-CH2），724微機型可見分光光度儀（上海光學儀器制造廠）。

2 方法

2.1 地衣芽孢桿菌的生長曲線測定

將菌株接入第一瓶營養肉湯培養基中37℃培養，12小時后將菌接入第二瓶營養肉湯培養基中，37℃培養。從第二瓶接入種開始計時，每隔30 min同時取兩瓶中的培養液用722分光光度計測其在600 nm的OD值，測定該菌株生長曲線[3]。

2.2 地衣芽孢桿菌的發酵時間的影響

將250 mL三角瓶中，裝40 mL營養肉湯培養基，菌接入營養肉湯培養基中，37℃，200 r/min培養備用；500 mL三角瓶中裝40 mL發酵液，按10%的接種量將備用菌液接種于發酵培養液中，37 ℃，200 r/min 培養。培養 24 h、31 h、48 h、54.5 h、82.5 h、96.5 h、120 h 時取樣，4000 r/min 離心 10 min，取上清，以此標記為 A、B、C、D、E、F、G，放冰箱下層（-20 ℃）保存[4]。

2.3 抑菌溶液的配制

（1）樣品發酵液的稀釋：將B、C發酵培養液的上清液按估計值 600 u/mL稀釋至 1 u/mL和 4 u/mL；D、E、F、G 發酵液按800u/mL稀釋至1u/mL和4u/mL，稀釋方法如下：

稀釋至4u/mL，見表1。

表1 發酵液按估計濃度稀釋至4 u/mL加樣表

稀釋至1 u/mL

取4 u/mL的樣品發酵液稀釋液1 mL，與pH6.0的磷酸緩沖液3mL混合得到。

（2）標準品溶液的稀釋：取0.2 g 53.5 u/mg的標準品，用0.01 M鹽酸，定容至100 mL，配成100 u/mL的備儲標準溶液Ⅰ。取備儲標準溶液110 mL，用0.01 M鹽酸，定容至100 mL，配成10 u/mL的備儲標準溶液Ⅱ。按下表，取儲備標準液Ⅱ與0.01 M鹽酸，用pH6.0的磷酸緩沖液定到100 mL。得到濃度為1 u/mL和4 u/mL的標準品溶液，見表2。

表2 標準液稀釋至1u/mL和4u/mL加樣表

2.4 桿菌肽產量生物法測定

每個藤黃八疊雙層平板上放置4個牛津杯，其中一條對角線上的兩個牛津杯中分別注入濃度為1 u/mL和4 u/mL的標準品溶液；另一條對角線上分別注入取樣品發酵液稀釋到的 1 u/mL和 4 u/mL濃度的溶液[5]。

3 結果

3.1 地衣芽孢桿菌的生長曲線測定

結果如圖1可知其生長對數期在4～12 h之間，選擇10 h做為種子培養時間。

圖1 地衣芽孢桿菌生長曲線圖

3.2 芽孢桿菌的發酵時間的影響

培養 24 h、31 h、48 h、54.5 h、82.5 h、96.5 h、120 h 時取樣，4000 r/min離心10 min，取上清，以此標記為，放冰箱下層（-20℃）保存。

抑菌實驗：通過生物法測定 A、B、C、D、E、F、G 7 個樣品中桿菌肽的抑菌情況。結果見表3。

表3 不同抑菌時間抑菌直徑測量數據表

P為樣品發酵液的效價濃度

AT為樣品發酵液的估計濃度

S1為濃度為1u/mL的標準品溶液的抑菌圈直徑

S4為濃度為4u/mL的標準品溶液的抑菌圈直徑

T1為濃度為1u/mL的樣品發酵液的抑菌圈直徑

T4為濃度為4u/mL的樣品發酵液的抑菌圈直徑

應用公式：P=（T1+T4）/（S1+S4）*AT計算，結果見表4。

表4 不同時間發酵液桿菌肽含量表

根據表4得到桿菌肽的產生趨勢：

圖2 桿菌肽產生趨勢圖

由圖2可知，在發酵的前期（6～24 h），桿菌肽產生呈上升趨勢；在發酵的中后期（24～54 h），桿菌肽的產量穩定，綜合分析以及從成本考慮得到桿菌肽的產生情況為：選擇發酵35 h，桿菌肽產量為，642.7 u/mL。

4 結語

通過對桿菌肽產生菌進行初步發酵條件摸索，首先將篩選到的菌株在營養肉湯細菌培養基進行種子瓶培養，通過間隔時間取樣測量菌體密度，確定種子瓶生長曲線。選擇菌體量較大，且菌體活力旺盛的對數生長后期作為發酵培養基的接種時間。這樣可保證菌株盡快繁殖代謝，以產生我們需要的桿菌肽。最終，實驗確定搖瓶培養10 h為種子瓶最佳時間。

發酵過程中，桿菌肽的生物檢測采用2005版中國獸藥藥典規定的抑菌圈法。生物法檢測儀器要求不高，通過發酵液對敏感菌藤花八疊球菌的抑菌圈直徑大小確定桿菌肽效價，為避免測量過程中各個平皿之間的誤差，每個平皿采用桿菌肽標準品同時測定，以校正誤差。通過對桿菌肽發酵過程監控，確定桿菌肽的產生情況為：選擇發酵35 h，桿菌肽產量為，642.7 u/mL。

[1]Raussens V，Narayanaswan V，Goormaghtigh E，et al.Hydrogen/Deuterium exchange Kinetics of apolipophorin-III in lipid-free and phospholipids-bund states[J].J Biol chem，1999，27（4）：89-95.

[2]薛志成.桿菌肽鋅在畜禽飼養中的應用.養殖與飼料[J].飼料與營養，2006，（1）：23-24.

[3]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[4]沈萍.微生物學[M].北京：高等教育出版社，2002.