O139,142,26混合血清型大腸桿菌的O-抗原基因簇的破譯

許亞卓，楊春柳，劉文鑫，楊旭東，李海濱，師東方

（東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030）

大腸桿菌的不同血清型分類是由大腸桿菌O-抗原決定的。大腸桿菌O-抗原是大腸桿菌細胞最外側結構，由多個重復的單糖單位組成，是構成大腸桿菌脂多糖的重要組成部分[1]。其單糖種類、數量以及單糖間鍵，寡糖單位之間鍵的不同構成了O-抗原的多樣性，根據O-抗原進行分類，大腸桿菌現已有180多種不同血清型[2-4]。O-抗原種類雖多，但都有固定結構模式，O-抗原基因一般分成三部分：單糖合成酶基因；糖基轉移酶基因和寡糖單位處理酶基因。這些結構基因都位于galF和gnd 2個看家基因之間。galF基因和gnd基因分別位于O-抗原基因簇的5′末端和3′末端，它們不屬于O-抗原基因簇[5]。這兩個看家基因在不同血清型大腸桿菌中都有相對保守的部分，比較穩定，可用來擴增O-抗原基因簇[3]。

師東方等從豬水腫病病死豬腸系膜淋巴結中分離到了一株O139,142,26混合血清型大腸桿菌[6]，這與以往的研究中曾發現過血清型交叉反應現象相符，Lothar等發現大腸桿菌O123的兩個H型分別與O4、O12發生交叉血清型反應[7]，O142與O106在發生了一個羧基改變后也發生了交叉血清型反應現象[8]，在牦牛體內[9]和試驗兔體內[10]分離到混合血清型大腸桿菌，出現2個或3個血清型交叉反應，以及其他菌屬與大腸桿菌之間都發生過血清型交叉反應現象[11]。本文通過鳥槍法擴增了O139,142,26混合血清型大腸桿菌分離株O-抗原基因，利用分子生物學軟件對其O-抗原基因簇進行分析，為進一步研究混合血清型大腸桿菌分子生物學特性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

O139,142,26混合血清型大腸桿菌，大腸桿菌TGⅠ由本實驗室保存。

1.1.2 質粒和試劑

PMD18-T Vector、PCR純化試劑盒購自Sigma公司、HiFiPCR酶、EasyTaq酶、dNTP購自北京全氏金公司；Eco R I、DNaseI購自日本TaKaRa公司；引物由上海生工生物技術公司合成；氨芐青霉素、氯仿、異戊醇、乙醚、醋酸鈉等常規試劑購自天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 O-抗原基因簇的獲得

根據galF基因設計上游引物P1：5′ATTGTG GCTGCAGGGATCAAAGAAAT 3′，根據gnd基因設計下游引物P2：5′TAGTCGCGTGNGCCTGGATTA AGTTCGC 3′。提取該大腸桿菌基因組DNA做為模板[1]，用長距離PCR方法擴增O-抗原基因簇。PCR反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，70℃延伸10 min，30個循環，終延伸為70℃，7 min，反應體系為50 μL。合并8管PCR產物，用PCR純化試劑盒純化。

1.2.2 O-抗原基因文庫的構建

用DNaseI消化PCR純化產物，1∶8 000稀釋DNaseI，在10 μL體系中加入7 μL PCR純化產物，1 μL 0.5 mol·L-1Tris-HCl（pH=7.5）、1 μL MnCl2（0.1 mol·L-1），反應 10 min，用 1 μL 5 mol·L-1EDTA，在65℃終止反應。使其酶切片段在500～3 000 bp之間，合并反應產物，用氯仿∶異戊醇和醋酸鈉對酶切產物進行純化。用PCR方法對酶切片段補平加A，再經氯仿∶異戊醇和乙醚純化，產物與pMD18-T載體在16℃連接24 h，取連接產物轉化感受態大腸桿菌TGⅠ，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養基上，37℃過夜培養，以堿裂解法大規模提質粒，用Eco RⅠ酶切鑒定其中的插入片段的大小，挑選插入片段在500～3 000 bp的克隆。為了保證序列的準確性，避免PCR反應本身的錯配，根據帕松公式（P=e-m，P-未測定堿基的概率；m-測定序列的覆蓋率）[12]，挑取了50個插入片段為500～3 000 bp的克隆進行測序拼接，使每個堿基至少有3個以上高質量（＞90%）的序列覆蓋，最終得到全基因序列。

2 結果與分析

2.1 O-抗原基因簇的獲得

根據galF和gnd基因設計上下游引物，用長PCR方法擴增O-抗原基因簇。長PCR產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在接近15 kb的位置出現一條電泳帶。將PCR產物酶切后，按前述方法挑取插入片段500～3 000 bp的克隆，測序拼接，最終獲得了大腸桿菌O139,142,26的O-抗原基因簇的全序列，序列全長11 771 bp。

2.2 O-抗原基因簇分析

在獲得混合O-抗原基因簇的全序列后，用ORF finder發現基因，共找到10個開放閱讀框（ORF），都位于galF基因和gnd基因之間且具有相同的轉錄方向，都是從5′～3′方向。用Artemis軟件完成基因注釋后得到大腸桿菌O139,142,26的O-抗原基因簇結構及其（G+C）%含量，如圖1所示。

圖1 大腸桿菌O139,142,26的O-抗原基因簇結構

galF基因和gnd基因分別位于O-抗原基因簇的5′末端和3′末端，它們不屬于O-抗原基因簇[5]。除這兩組基因外O-抗原基因簇還含有3種酶基因，即單糖合成基因，糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因[3]。

2.2.1 單糖合成酶基因

通過進行BLAST比較發現，ORF1、ORF2、ORF3和ORF4都與許多菌的合成鼠李糖前體的4個合成酶基因有非常高的相似性，其中與大腸桿菌O139的rmlB、rmlD、rmlA、rmlC相似性最高，分別為97.63%、98.45%、99.66%、98.15%，并且都與鮑氏志賀氏菌的rml有97%以上相似性?？梢源_定 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4分別為合成dTDP-鼠李糖的rmlB、rmlD、rmlA、rmlC基因，因此分別命名為rmlB、rmlD、rmlA、rmlC。

2.2.2 寡糖單位處理基因

通過TMHMM和SMART分析，ORF5和ORF7是僅有的2個具有多個以上跨膜蛋白的序列，ORF5有11個跨膜蛋白，并在第2和第3個跨膜蛋白之間有一個含92個氨基酸殘基的大型胞質莖環，這是wzy跨膜蛋白的典型結構[13]，經過BLAST保守蛋白分析，與大腸桿菌O139的O-抗原跨膜基因相似性達到99.75%；ORF7有9個跨膜蛋白，也具有高度特異性，與大腸桿菌O139O-抗原跨膜基因相似性達到99.43%。因此將ORF5與ORF7分別命名為wzy、wzx。

2.2.3 糖基轉移酶基因

經過BLAST分析，ORF6、ORF8、ORF9、ORF10與大腸桿菌O139編碼糖基轉移酶wfaI、wfaJ、wfaK、wfaL，相似性分別為99.2%、98.88%、99.23%、98.7%，推測它們屬于糖基轉移酶家族類蛋白，但不能確定其作用的糖苷健類型，與其他菌也有一定的相似性，如ORF9與假單胞桿菌的wbpR糖基轉移酶的相同性為36%，相似性為53%，所以根據其特點及與已發表的O139抗原基因有較高的同源性將ORF6、ORF8、ORF9、ORF10 命名為 wfaI、wfaJ、wfaK、wfaL[14]。

通過對每個ORF用BLAST系列軟件與Gen-Bank中的基因比較預測出它們的功能如表1所示。

表1 O139,142,26大腸桿菌O-抗原基因簇中基因的功能Table 1 Function of genes on E.coli O139,142,26O-antigen gene cluster

2.3 大腸桿菌O139、O26及O142的O-抗原基因簇及糖基鏈的比較

根據GenBank中發表的 O139（序列號 DQ109 552）、O26（序列號AY763106）基因序列可知，除wzx與wzy 2個特殊的跨膜蛋白合成基因具有較高的特異性以外，其他開放閱讀框都有部分相似性，如它們都含有合成鼠李糖前體的4個基因rmlB、rmlD、rmlA、rmlC，并且相似性都在93%以上，在其他的糖基轉移酶中O139的wfaI、wfaJ糖基轉移酶基因與O26的糖基轉移酶基因fnl2、fnl1相似性為33.15%和33.5%，O139的wfaK、wfaL糖基轉移酶基因與O26的糖基轉移酶基因wbuB、wbuA相似性為30.95%和40.15%。

瑞典學者Landersjo等[15]對O142和O139的O-抗原外部糖基結構進行了測定，發現了它們重復的單糖結構。O142O-抗原含有 α-D-GalpNAc、α-L-Rhap、β-D-GlcpNAc；O139O-抗原含有 α-D-GlcpNAc、α-L-Rhap、α-D-GalpA、β-D-Glcp，它們的糖基大部分成分相同。比較O142O-抗原基因序列[16]，發現大腸桿菌O142也含有鼠李糖前體合成基因rmlB、rmlD、rmlA、rmlC，并且與O139相似性很高。

通過DNAMAN比對基因相似性，大腸桿菌O139,142,26與O139（序列號DQ109552）相似性為99.7%，與O26（序列號AY763106）相似性僅為44.15%。與大腸桿菌O139相比，O139,142,26全基因序列共有32處不同，各段開放閱讀框相似性都在99%以上，除了合成鼠李糖前體的單糖合成酶基因（rmlB、rmlD、rmlA、rmlC）有21處不同外，就只有O139,142,26糖基轉移酶基因wfaL與O139的糖基轉移酶基因wfaL段出現了最多的6處不同，是相對其他片段變異較大的。而與大腸桿菌O26相比，除合成鼠禮糖前體的單糖合成酶基因相似性在75%以上，其他片段比對結果同大腸桿菌O139與O26比對結果相同，其中O139,142,26的糖基轉移酶基因wfaL與O26糖基轉移酶基因wbuA的相似性為40.15%，是相對于其他片段相似性較高的。

2.4 wfaL基因的進化分析

由于大腸桿菌O139,142,26與O139,的wfaL片段具有相對較高的變異性，大腸桿菌O139,142,26的wfaL片段與O26的wbuA片段具有相對較高的相似性，所以預通過wfaL氨基酸序列的進化關系來分析大腸桿菌O139,142,26、O139,、O26O-抗原之間的進化關系。經BLAST protein分析尋找wfaL的相似序列，從這些相似序列中選擇了包括O139和O26在內的value值在5e-18以上的共17個序列，用MEGA進化樹分析它們的同源性（見圖2）。將O139,142,26暫時命名為E.mix，其他命名都為簡寫。從圖2中可以看出O139,142,26與O139,落在一個分支里，和R.JMP134（蛋白序列號為YP_294950）是同一個祖先，都是糖基轉移酶家族蛋白的成員，而O26和Psychromonas ingrahamii 37（蛋白序列號為YP_944740）落在同一分支里，與O139,142,26相距較遠，屬于糖基轉移酶類似蛋白。因此，大腸桿菌O139,142,26的wfaL很可能是由大腸桿菌O139的wfaL單獨演變而來的。

圖2 根據相似蛋白序列構建的wfaL系統近化樹Fig.2 Phylogenetic trees based on wfaL proteins sequences showing the relationships numbers in parentheses represent the accession number of the protain sequences in GenBank;the number at each branch points of the percentage supported by bootstrap

3 討論與結論

在O-抗原基因簇中，寡糖單位處理酶基因包括O-抗原轉運酶基因wzx和O-抗原聚合酶基因wzy，由于wzx、wzy跨膜基因的高度特異性，近年來有學者用分段設計wzx、wzy序列引物的PCR方法來快速準確地鑒定大腸桿菌的血清型[17-19]，說明這兩個基因片斷對O-抗原免疫原性的形成具有決定性作用。但是由于O139,142,26和O139大腸桿菌的wzx、wzy跨膜基因相似性很高，所以用PCR方法很難將它們區分開。根據二級結構預測抗原決定簇方法[20]，分析O139,142,26與O139跨膜基因，預測到wzy的第99位和第330位氨基酸的突變部位很可能處于抗原決定簇內，這些突變很可能改變wzy跨膜蛋白的性質，如拓撲學變化，解旋及親水集團的轉移等，從而使形成的糖前體在跨膜轉運時發生變化，引起O-抗原糖基鏈的改變，從而出現混合血清型現象。以上對大腸桿菌O-抗原混合血清型產生的原因分析還需進一步研究證明。

[1]Bastin D A,Reeves P R.Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111[J].Gene,1995,164(1):17-23.

[2]Whitfield C.Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens[J].Trends in Microbiology,1995,3:178-185.

[3]Reeves P R,Wang L.Genomic organization of LPS-specificloci[J].Curr Top Microbiol Immunol,2002,264(1):109-35.

[4]Stenutz R,Weintraub A,Widmalm G.The structures of Escherichia coli O-polysaccharide antigens[J].FEMS Microbiol Rev,2006,30:382-403.

[5]Marolda C L,Valvano M A.The GalF protein of Escherichia coli is not a UDP-glucose pyrophosphorylase but interacts with the GalU protein possibly to regulate cellular levels of UDP-glucose[J].Mol Microbiol,1996,22:827-840.

[6]師東方,葛俊偉,王明翠,等.一株混合O血清型豬水腫病大腸桿菌的分離與鑒定[J].中國預防獸醫學報,2009(5):397-355.

[7]Lothar B,Wang Q,Dieter N,et al.Relationship between O-antigen subtypes,bacterial surface structures and O-antigen gene clusters in Escherichia coli O123strains carrying genes for Shiga toxins and intimin[J].Journal of Medical Microbiology,2007,56:177-1840.

[8]Hanna K,Jonsson M,Weintraub A,et al.Structural studies of the O-antigenic polysaccharides from Shigella dysenteriae type 3 and Escherichia coli O124,a reinvestigation[J].Carbohydrate Research,2006,341:2986-2989.

[9]索朗斯珠,曾群輝,查果,等.西藏牦牛大腸埃希氏菌的分離鑒定與毒力測定[J].西北農林科技大學學報,2005,33(9):19-23.

[10]王云峰,王翠蘭,崔尚金.兔致病性大腸桿菌生物學特性的研究[J].中國預防獸醫學報,1999,21(5):354-355.

[11]Guang Z,Perepelov A V,Senchenkova S N,et al.Structural relation of the antigenic poly-saccharides of Escherichia coli O40,Shigella dysenteriae type 9,and E.coli K47[J].Carbohydrate Research.2007,342:1275-1279.

[12]徐建國.分子醫學細菌學[M].北京:科學出版社,2000.

[13]DanielsC,VindurampulleC,MoronaR.Overexpressionandtopology of the Shigella flexneri O-antigen polymerase(Rfc/Wzy)[J].Mol Microbiol,1998,28:1211-1222.

[14]Wang L,Liu B,Kong Q,et al.Molecular markers for detection of pathogenic Escherichia coli strains belonging to serogroups O138and O139[J].Veterinary Microbiology,2005,111:181-190.

[15]Landersjo C,Weintraub A,Widmalm G.Structural analysis of the O-antigenic polysaccharide from the enteropathogenic Escherichia coli O142[J].Eur J Biochem,1997,244:449-453.

[16]孔慶科.大腸桿菌O138O-抗原基因簇的破譯及糖合成酶基因的功能鑒定[D].天津:南開大學,2004:79-80.

[17]Wang L,Reeves P R.Organization of Escherichiacoli O157O antigen gene cluster and identification of its specific genes[J].Infection and Immunity,1998(9):3545-3551.

[18]王威,彭霞,王荃,等.大腸桿菌O11O-抗原基因簇序列的破譯及特異分子標識的鑒定[J].微生物學報,2006,46(3):341-346.

[19]程劍松,王威,王荃,等.大腸桿菌O23O-抗原基因簇序列的破譯及UDP-N-乙酰葡萄糖-C4異構酶的鑒定[J].微生物學報,2006,46(5):702-708.

[20]孫瑛勛,欒曉,孫啟鴻,等.合成多肽為半抗原制備抗SCF受體單克抗體[J].細胞與分子免疫學雜志,1998,14(2):126-129.