克隆啟動子方法的比較及應用

郝迪 ，趙 琳，陳李淼，李文濱

（東北農業(yè)大學大豆生物學教育部重點實驗室，大豆研究所，東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030）

隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構建一種能高水平表達異源蛋白質的表達載體。啟動子對外源基因的表達水平影響很大，是RNA聚合酶能夠識別并與其結合、從而起始基因轉錄的一段DNA序列，是基因工程表達載體的重要元件?；騿幼拥目寺。瑢ρ芯恐参锘虮磉_調控和構建表達載體至關重要。文章就近幾年來克隆植物基因啟動子的各種方法做一綜述，為啟動子分離技術的應用提供理論參考。

1 啟動子克隆的幾種方法

1.1 PCR技術克隆啟動子

對于序列已知的啟動子，即根據發(fā)表的基因序列，設計引物，用PCR技術克隆基因的啟動子。由于PCR法簡便快捷，近年來被較多應用于克隆基因啟動子。

Wang等根據GenBank中擬南芥基因組序列中ats1A（核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基）基因的前部疑似啟動子區(qū)域設計引物，以擬南芥總DNA為模板，PCR擴增出ats1A的基因啟動子區(qū)片段[1]。蘇寧等根據已報道的水稻葉綠體16S rRNA基因前部疑似啟動子區(qū)域設計引物，以水稻葉綠體DNA為模板，PCR擴增出16S rRNA基因5'啟動子區(qū)的片段。同源比較結果表明，所克隆的片段與水稻葉綠體16S rRNA啟動子序列具有100%的同源性。可見，該方法簡便、快捷、操作簡單，但不能克隆到全新的啟動子[2]。

1.2 I-PCR技術

I-PCR又稱反向PCR（Inverse-PCR），是1988年由Triglia最早提出的一種基于PCR的改進的染色體步行方法。I-PCR的試驗程序包括，基因組DNA經酶切后用T4DNA連接酶進行自連接，產生環(huán)狀DNA片段；以環(huán)化產物為底物，用根據已知片段設計的反向引物進行PCR擴增，從而得到含有未知片段的擴增產物，見圖1[3]。

Forester等用該方法克隆了豌豆種子脂肪加氧酶基因啟動子，約800 bp片段[4]。韓志勇等以IPCR技術為基礎克隆了轉基因水稻的外源基因旁側序列[5]。

I-PCR法快速、高效、穩(wěn)定，操作相對簡單，花費少，PCR引物設計比較方便。

1.3 P-PCR技術

P-PCR（Panhandle PCR）是由Jones等提出的利用末端反向重復序列與已知序列互補配對形成環(huán)狀單鏈模板，有效增強了引物與模板結合的特異性。反應需要3個根據已知序列設計的引物，3個引物在已知序列內呈線性排列，其中第3個引物可作為接頭使用，可與已知序列互補配對形成鍋柄狀單鏈模板（見圖 2）[6]。

黃君健等成功地應用P-PCR技術從正常的人外周血單核細胞基因組DNA中擴增端粒催化亞基hTERT基因5'端上游旁側序列，獲得了hTERT基因翻譯啟始位點上游2 090 bp的基因組DNA序列[7]。

圖1 I-PCR原理Fig.1 Sketch map of I-PCR

圖2 鍋柄PCR原理Fig.2 Sketch map of P-PCR

P-PCR是目前能夠擴增距已知序列最遠的未知DNA序列的方法，有很高的特異性。

1.4 錨定PCR技術

錨定 PCR（Anchored PCR）是由Huang等提出的擴增已知序列側翼未知片段的方法。反應中需要2個根據已知序列設計的引物，2個根據載體序列設計的引物，然后分別利用一條已知序列特異性引物和載體上非特異性引物進行PCR擴增。其操作一般包括3輪PCR擴增，第1輪采用不對稱PCR的方法，在擴增時使用兩種引物濃度不同，一般高濃度引物與低濃度引物比為（50～100）∶1，在最初10～15個循環(huán)的產物主要是雙鏈DNA，待低濃度引物耗盡后，繼續(xù)由高濃度引物介導產生大量單鏈DNA。第2輪中，把第1輪PCR產物稀釋后做模板，引物為相同濃度的特異性引物和非特異性引物，這一輪可得到雙鏈DNA。第3輪PCR目的主要是檢測所得PCR產物是否為預期產物，結果見圖3[8]。

圖3 錨定PCR的流程Fig.3 Schematic diagram of anchored PCR method

范云等用錨定PCR克隆了胡蘿卜AFP（抗凍蛋白）基因上游序列[9]。

此方法需要知道啟動子相鄰序列，且要構建基因組文庫。

1.5 探針載體篩選啟動子

利用啟動子缺失的報告基因構建啟動子探針質粒，通過報告基因的表達來克隆有啟動功能的DNA片段。在該技術中關鍵是要構建一種啟動子探針載體。探針型載體是一種有效、經濟、快速分離基因啟動子的工具型載體，包含2個基本部分：轉化單元和檢測單元。其中，轉化單元含復制起點和抗生素抗性基因，用于選擇被轉化的細胞；檢測單元則包括1個已失去轉錄功能且易于檢測的遺傳標記基因以及克隆位點。

利用啟動子探針載體篩選啟動子的過程為，先選用1種適當的限制性核酸內切酶消化切割染色體DNA，然后將切割產生的DNA限制片段群體與無啟動子的探針質粒載體重組，并按照設計的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報告基因的上游位置；隨后再把重組混合物轉化給寄主細胞，構建質粒載體基因文庫，并檢測報告基因的表達活性。

最早由Rachael等在大腸桿菌中以四環(huán)素抗性基因作為報告基因構建了啟動子探針質粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核啟動子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作為報告基因，Fodor等以大腸桿菌LacZ為報告基因，構建了酵母啟動子探針質粒并克隆了一些啟動子片段。張曉寧等用啟動子探針載體pECE7克隆了鹽藻耐鹽基因的啟動子[10-13]。

該方法不需要知道具體基因的序列，可隨機篩選啟動子，避免了引物設計，能獲得大量的啟動子片段。

1.6 利用載體或接頭的染色體步行技術克隆基因啟動子

該方法首先要提取基因組DNA，用限制性內切酶消化，產生出適合于克隆的DNA片段，然后在體外將這些DNA片段同適當的λ噬菌體載體連接成重組體分子，并轉化到大腸桿菌的受體細胞中，構建基因組文庫。將構建好的基因組文庫鋪板，轉移到尼龍膜上，用部分已知序列的片段或特異的基因片段做探針進行雜交，篩選出具有目的啟動子的克隆，測序分析即可獲得該啟動子。

王新國等利用銜接頭的方法[14]，設計了位于單鏈DNA兩端互補的顛倒末端重復序列，增加了反應的特異性，在胡蘿卜II型轉化酶基因啟動子的克隆方面取得了新的進展。

這種方法具有便于操作、試驗線路簡單的優(yōu)點，但是特異性較差，產物需進一步雜交驗證。

1.7 YADE法

Prashar等在擴增cDNA 3'端時采用“Y”形接頭，以減少接頭引物的單引物擴增[15]。

其原理是接頭引物處于“Y”接頭的2個分叉單鏈上，序列與接頭一樣，只有與特異引物引導合成了接頭的互補序列后，接頭引物才能退火參與擴增（見圖 4）。

圖4 YADE法的流程Fig.4 Schemtic diagram of YADE

方衛(wèi)國等嘗試將YADE法引入到昆蟲病原真菌的分子生物學研究[16]。在已克隆的類球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的基礎上，利用YADE法，克隆到該基因的啟動子CDEPP。過程是先酶切球孢白僵菌基因組DNA，然后與“Y”形接頭相連，取連接產物做模板，先以基因特異引物1做線性擴增，再以線性擴增產物為模板，以接頭引物和基因特異引物2做指數擴增，只有當線性擴增時合成了含有接頭引物的互補單鏈，接頭引物才能與其發(fā)生退火，參與指數擴增，從而有效防止了接頭引物的單引物擴增。最后得PCR產物，進行序列分析確定為CDEP-1的上游啟動子序列。

在應用YADE法時，內切酶的選擇至關重要。好的內切酶產生適合PCR擴增的片段，太大太小都不行。為了得到合適的內切酶，需要從眾多的內切酶中篩選。研究表明，不同的物種有自己合適的內切酶。YADE法延伸的起始片段可以是基因組DNA片段，也可以是cDNA片段，在延伸cDNA片段時，設計的引物需要避開內含子和外顯子的邊界，在內含子的位置未知的情況下，可考慮多合成1～2條特異引物，以提高擴增未知片段的機率。該方法假陽性低、效率高，理論上能擴出所有目的片段。

1.8 接頭PCR技術

接頭PCR是繼I-PCR方法之后的又一用來擴增基因組中已知序列兩側未知序列的方法。當基因序列已知，要克隆此基因啟動子時即可使用此方法，其原理如下：首先，用幾種限制性內切酶酶切DNA，然后將酶切后的DNA與體外合成的接頭在適當的條件下連接，取適量連接產物直接作為PCR模板，其中一條引物為接頭特異引物，其序列能與接頭序列互補；另一條引物為基因特異引物，其序列與已知序列互補，該引物3'端朝向要擴增的序列區(qū)。最后將PCR產物克隆并測序。

在這種方法中，有一個特殊的接頭，該接頭由一條長鏈和短鏈組成，短鏈接頭的3'端有一個NH2的存在，它能阻斷短接頭鏈的酶促延伸，而且只有當一條遠端的基因特異引物相對長鏈接頭方向延伸一條DNA鏈后，才能產生引物結合位點。如果產生了兩末端都含有雙鏈接頭序列的PCR產物（非特異性PCR產物），由于反向重復序列的存在，在緊接著的每步變性過程中DNA鏈的末端會形成發(fā)夾結構。這些結構比引物與模板的雜交鏈更穩(wěn)定，因此會抑制指數式擴增。然后，當一個遠端的基因特異性引物通過接頭延伸一條DNA鏈，延伸產物將只有一端會有接頭序列，這樣就不能形成發(fā)夾結構，PCR擴增能正常進行。

王新國等利用這種特殊的接頭設計了位于單鏈DNA兩端互補的顛倒末端重復序列，一條長鏈接頭序列和一條短鏈接頭序列，增加了反應的特異性，在胡蘿卜Ⅱ型轉化酶基因啟動子的克隆方面取得了新的進展[14]。根據接頭PCR的原理，TaKaRa公司推出了LA-PCR體外克隆試劑盒（DDR015）。用來克隆基因側翼未知序列。Miao用試劑盒克隆了小麥淀粉合成酶基因gbss的啟動子序列。Li等也用LA-PCR試劑盒的方法，首次分離了長度為1 216 bp的山葡萄幾丁質酶基因VCH3上游啟動子序列[17-18]。

1.9 TAlL-PCR技術

熱不對稱交錯PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，簡稱TAIL-PCR）是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學技術。該技術由Liu和Whitter首先研究并報道。在分子生物學研究領域中，利用該技術分離出的DNA序列可以用于圖位克隆、遺傳圖譜繪制的探針，也可以直接測序[19-20]。

TAIL-PCR技術的基本原理是利用目標序列旁的已知序列設計3個嵌套的特異性引物（specialprime，簡稱sp1，sp2，sp3，約20 bp），用它們分別和1個具有低Tm值的短的（14 bp）隨機簡并引物（Arbitrary Degenerate Prime，ADP）相組合，以基因組DNA作為模板，根據引物的長短和特異性的差異設計不對稱的溫度循環(huán)，通過分級反應來擴增特異引物。反應流程如圖5所示。由一個特異性引物和一個簡并引物組合構成的PCR反應叫做“半特異性PCR”。這種反應會產生3種不同類型的產物：①由特異性引物和簡并引物擴增出的產物；②由同一特異性引物擴增出的產物；③由同一簡并引物擴增出的產物。在TAIL-PCR反應中，后兩種非目標產物可以通過以嵌套的特異性引物進行的后續(xù)反應來消除。

圖5 TAIL-PCR反應流程Fig.5 Protocol of TAIL-PCR

TAIL-PCR反應的條件在不同的試驗中稍有變化。在表1所示的條件下對P1和YAC克隆插入末端序列的分析中獲得了滿意的結果。這種反應條件亦是一個規(guī)范的試驗設置，可以滿足大多數試驗的需要。反應體系中，特異性引物的濃度與普通的PCR相同，簡并引物的濃度要高，一般為2.5～5 μmol·L-1，以滿足引物的結合效率。（簡并引物AD1：TGWGNAGWANCASAGA；AD2：CAWCGIC NGAIASGAA；AD3：TCSTICGNACITWGGA；AD4：NTCGASTWTSGWGTT；AD5：NGTCGASWGANAW GAA；AD6：WGTGNAGWANCANAGA；AD7：AG WGNAGWA NCAWAGG；D=G，A，T；M=A，C；N=A，G，C，T；R=A，G；S=G，C W=A，T）。

目前已成功地從P1、YAC和BAC克隆中分離獲得插入末端的DNA序列，如表1的T-DNA側翼序列。此外，經過改良的TAIL-PCR技術能夠快速克隆Pal及Pgi基因的啟動子序列和野油菜黃單胞菌群體感應信號基因。

TAIL-PCR技術能夠快速地分離到目標序列，對基因克隆研究具有重要的意義。TAIL-PCR技術有以下優(yōu)點：①簡單。只要設計好引物，即可以用基因組DNA作模板直接篩選到目標序列，節(jié)省了PCR反應前后的許多費時、費力的操作程序。②特異性高。用短的簡并引物和長的特異性嵌套引物相組合，通過不對稱的溫度循環(huán)和分級反應，使反應體系有利于特異引物的擴增，最終的擴增產物中目的片段占絕對優(yōu)勢，反應產物可以直接用做探針標記和測序模板。③高效靈敏。使用任何一個AD引物，在60%～80%的反應中能夠產生特異性產物。運用不同的AD引物就能夠有效地擴增到目標片段。④快速。整個TAIL-PCR反應循環(huán)能夠在1 d內完成，可以快速地獲得目標片段。⑤不涉及連接反應。反應產物準確可靠，重復性好。

2 啟動子克隆方法比較

以上介紹的幾種方法基本代表了現有的啟動子克隆方法，它們分別具有不同的特點和適用范圍，見表2。

表1 TAIL-PCR反應分離P1和YAC克隆的插入末端序列Table 1 Cycling conditions used for TAIL-PCR of P1and YAC clone

表2 啟動子克隆方法比較Table 2 Comparison of promoter clone methods

3 展望

目前，啟動子克隆的方法種類繁多，進展迅速。啟動子克隆方法絕大多數是建立在PCR的基礎上的染色體步行技術，因而利用啟動子克隆的方法不僅可以克隆到基因的啟動子，同時還可以用于克隆cDNA的全長。另外，隨著基因工程的發(fā)展，出現了越來越多的轉基因動植物，啟動子克隆的方法也可以應用在轉基因生物的研究中，如轉基因水稻的T-DNA區(qū)，通過啟動子克隆方法的PCR步行技術，能成功地克隆到T-DNA區(qū)的旁側序列，有助于分析突變體中突變區(qū)序列。

隨著PCR技術的不斷進步，一定會有更多、更好的克隆啟動子的方法產生，而它們最后也將會是克隆基因全長或突變體（特別是轉座子插入突變體）中目的基因的簡便、高效的新方法。

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