Taqman三重實時PCR快速檢測原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌

張紅宇，孟祥晨，姜 博，張偉欽

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030）

通常將致瀉性大腸埃希氏菌分為五大類，腸致病性大腸埃希氏菌（Enteropathogenic E.coli，E PEC）、腸產毒性大腸埃希氏菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（Enteroin-vasive E.coli，EIEC）、腸出血性大腸埃希氏菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）以及腸集聚性大腸埃希氏菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）[1]。致瀉性大腸埃希氏菌的致病癥狀主要是引發不同程度的腹瀉，其感染劑量一般為106～108cfu[2]。

近年來，各國由致瀉性大腸埃希氏菌引起的食物中毒事件時有發生。1996年6月到12月，日本爆發O157∶H7大腸埃希氏菌感染事件，出現了大量食物中毒病人，感染期間全國共中毒9451人，死亡6人[3]。南昌市1998年8月發生一起由腸侵襲性大腸埃希氏菌[EIEC O124∶ K72（B17）]引起的食物中毒爆發，致27人發生感染性腹瀉病[4]。青島市區東部某鄉鎮由ETEC引起的井水污染，從2006年9月17日出現首例病人至9月29日出現最后1例發病病人，共發現169例患者出現惡心、嘔吐、腹痛、發熱等癥狀并伴有大量水樣腹瀉[5]。在各起致瀉性大腸埃希氏菌感染事件中，最常見的有三種，即EPEC、EIEC、ETEC，針對基因型的檢測通常采用eae、ipaH、lt和st基因[6-9]。對于ETEC，相對于st、lt是更主要的毒素。本研究即針對以上3種常見的致瀉性大腸埃希氏菌的三種致病基因，采用Taqman探針檢測技術，建立了可快速檢測原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌三重實時PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器與主要試劑

7500實時熒光PCR儀和9700PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；凝膠成像系統（美國UVP公司）；1360型生物潔凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；TaqDNA聚合酶、dNTPs和細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；致瀉性大腸埃希氏菌診斷血清試劑盒（寧波天潤生物藥業有限公司）。

1.1.2 菌株與培養基

腸致病性大腸埃希氏菌44706、腸侵襲性大腸埃希氏菌44350和單增李斯特菌NICPBP54002（中國藥品生物制品檢定所）；腸產毒性大腸埃希氏菌CVCC197（中國獸醫藥品監察所）；大腸埃希氏菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923（黑龍江省應用微生物研究所）；熒光假單胞菌As1.1082（中國科學院北京微生物研究所）；枯草芽孢桿菌ATCC6051（中國普通微生物菌種保藏中心）；植物乳桿菌KLDS1.0314和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028（均由本實驗室保存）。大腸埃希氏菌的繼代培養使用LB培養基，分離鑒別培養使用伊紅美蘭瓊脂培養基，其他參考菌株選擇營養肉湯液體培養基。

1.1.3 原料乳來源

采自哈爾濱市周邊農場及農戶的原料乳。

1.2 引物與探針

依據文獻[10]針對eae致病基因設計的引物和探針分別由上海Invitrogen公司和大連TaKaRa有限公司合成，其探針的發光基團和淬滅基團分別為JOE和TAMRA；依據文獻[11-12]針對ipaH致病基因設計的引物和探針分別由上海Invitrogen公司和大連TaKaRa有限公司合成，其探針的發光基團和淬滅基團分別為FAM和BHQ1；依據文獻[13-14]針對lt致病基因設計的引物和探針均由上海Invitrogen公司合成，其探針的發光基團和淬滅基團分別為CY5和BHQ2。具體序列見表1。

表1 所用引物和探針Table 1 PCR primers and TaqMan probes used in this study

1.3 方法

1.3.1 原料乳中細菌基因組DNA的提取

為降低乳中所含物質對DNA提取純度的影響，本文對Rademaker的方法[15]進行了改良：取1 mL待測原料乳，加入150 μL 18%（W/V）的檸檬酸鈉和 100 μL 4%（W/V）NaOH，10 000 r·min-1離心 10 min，收集菌體細胞，加入1 mL PBS緩沖液吹打沉淀，于12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，再加入1 mL 1×TE 吹打沉淀，于 12 000 r·min-1離心 2 min，棄上清，將收集到的菌體用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3.2 Taqman三重實時PCR方法的反應條件

本試驗選用50 μL反應體系，具體組分為：3 U的 Taq DNA 聚合酶，10×PCR緩沖液（無 Mg2+）5 μL，dNTPs（各2.5 mmol·L-1）5 μL，Mg2+（25 mmol·L-1）5 μL，EPEC、EIEC 和 ETEC 模板各 2 μL，Rox參比染料（1×）1 μL，eae探針（10 μmol·L-1）2.0 μL，ipaH探針（10 μmol·L-1）1.8 μL，lt探針（10 μmol·L-1）1.2 μL， eae 上下游引物（10 μmol·L-1）各 2 μL，ipaH 上下游引物（10 μmol·L-1）各 3 μL， lt上下游引物（10 μmol·L-1）各 3 μL。

所確定的三重Taqman熒光PCR體系的循環參數為：

有下劃線的步驟表示在此階段末端收集熒光信號。

1.3.3 人工污染致瀉性大腸埃希氏菌乳樣的制備

將EPEC或EIEC或ETEC培養液按照1%接種量接種于超高溫滅菌乳中，37℃，200 r·min-1振蕩培養16 h，即為人工污染乳樣。

1.3.4 特異性檢測

以EPEC 44706、EIEC 44350和ETEC CVCC197的DNA為陽性模板，以大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、單增李斯特菌NICPBP54002、植物乳桿菌KLDS1.0314、熒光假單胞菌As1.1082和枯草芽孢桿菌ATCC6051的DNA為陰性模板，建立11個三重PCR反應體系，第1個反應管中加入EPEC、EIEC和ETEC的DNA，第2～4個反應管中分別加入EPEC、EIEC和ETEC兩兩組合的DNA，第5～11個反應管中分別加入7種陰性對照的DNA，同時以去離子水做空白對照，進行同一批次的三重實時PCR擴增，檢測各個反應中JOE、FAM和CY5熒光基團有無指數期增長變化，以此判定本試驗所采用引物及探針的特異性是否良好。

1.3.5 靈敏度檢測

將已知 EPEC 含量（約為 4.30×107cfu·mL-1）的乳樣加入到一系列滅菌原料乳中，分別調節乳樣中EPEC 濃 度 約 為 4.30 ×106、 4.30 ×105、 4.30 ×104、4.30×103、4.30×102、2.15×102、1.08×102、4.30×101和 4.30×102cfu·mL-1；將已知 EIEC 含量（約為2.81×108cfu·mL-1）的乳樣加入到一系列滅菌原料乳中，分別調節乳樣中 EIEC濃度約為2.81×107、2.81×106、2.81×105、2.81×104、2.81×103、2.81×102、1.41×102、2.81×101cfu·mL-1；同樣，將已知ETEC 含量（約為 1.08×108cfu·mL-1）的乳樣加入到一系列滅菌原料乳中，分別調節乳樣中ETEC濃度約 為 1.08 ×107、 1.08 ×106、 1.08 ×105、 1.08 ×104、1.08×103、5.40×102、2.70×102、1.08×102、1.08×101cfu·mL-1。再按照1.3.1方法分別提取上述乳樣中細菌基因組DNA，提取的DNA分別用Taqman三重實時PCR進行擴增，根據擴增曲線的形態及Ct值確定該方法的檢測限。

同時分別將菌含量均約為1 cfu·mL-1的EPEC、EIEC和ETEC乳樣置于37℃，200 r·min-1搖床培養，分別于培養0、1、2和3 h后各取1 mL，按照1.3.1方法提取細菌基因組DNA，所提DNA用于Taqman熒光PCR擴增，以確定當檢測限為1 cfu·mL-1時的增菌時間。

1.3.6 重復性檢測

將 37 ℃振蕩（200 r·min-1）培養 16 h后，已知 EPEC濃度約為 4.30×107cfu·mL-1，EIEC濃度約為 2.81×108cfu·mL-1，ETEC 濃度約為 1.08×108cfu·mL-1的3種乳樣，分別進行10和100倍稀釋，按照1.3.1方法分別提取乳樣的基因組DNA，每種菌株各得到3組濃度不同的DNA模板，按照已經確定的1.3.2方法對3組不同濃度的DNA進行批內和批間重復性檢測。在批內重復性檢測中，DNA模板選取以上3種濃度；在批間重復性檢測中，DNA模板只選取一種濃度（所對應的ETEC的濃度約為1.08×108cfu·mL-1，EIEC 的濃度約為 2.81×107cfu·mL-1，EPEC濃度約為4.30×105cfu·mL-1），分5批次重復進行PCR反應。以上每一種反應體系均同時做3個重復，最后對獲得的Ct值進行匯總，通過計算樣品不同Ct值的變異系數來評定該方法的重復性。

1.3.7 原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌的檢測

采集哈爾濱市內及周邊地區小型奶牛場或奶牛養殖戶共38份原料乳樣品，于37℃，200 r·min-1搖床培養2 h后，按照1.3.1方法提取DNA，所提取的DNA按照1.3.2方法進行三重熒光PCR擴增。同時采用中華人民共和國國家標準GB/T 4789.6-2003文獻[6]。比較國標方法和本研究所建立方法的檢測結果。

2 結果與分析

2.1 特異性檢測

三種原料乳中常見的致瀉性大腸埃希氏菌和7種陰性對照菌株經三重實時PCR檢測后結果見圖1。每個反應管中均含JOE、FAM和CY5（分別代表eaeP、ipaHP和ltP探針的熒光信號）3種熒光探針，管與管之間的區別在于DNA種類的不同。管1中含有三種菌的DNA，對管1檢測到3條熒光曲線，一條為JOE熒光形成，一條為FAM熒光形成，另一條為CY5熒光形成。管2中有EPEC和EIEC兩種菌的DNA，故只有兩條熒光曲線。管3中只有EIEC和ETEC兩種菌的DNA，故只有FAM和CY5的熒光曲線。管4中只有EPEC和ETEC兩種菌的DNA，故只有JOE和CY5的熒光曲線。管5～11分別為其他菌的DNA，均未檢測到熒光增加信號，表現為陰性。由此看出，三重熒光PCR反應時3種探針的熒光擴增曲線，與3種探針兩兩組合反應時并無明顯區別，也說明引物和探針與其他致病菌無交叉反應，三重熒光PCR具有良好的特異性。

圖1 以目的菌株DNA與陰性對照菌株DNA為模板的Taqman三重實時PCR擴增Fig.1 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with DNA of target strains and negative control strains

2.2 靈敏度檢測

從圖2可以看出，當EIEC含量在2.81×108～1.41×102cfu·mL-1時，均能檢測到熒光信號和Ct值，但在EIEC含量為1.41×102cfu·mL-1時，擴增曲線已經不明顯，且Ct值為32.67，明顯大于30，因此，Taqman三重實時PCR對EIEC的檢出限可達到2.81×102cfu·mL-1，同理可得出，Taqman 三重實時PCR對EPEC的檢出限可達到2.15×102cfu·mL-1（見圖3），對ETEC的檢出限可達到5.40×102cfu·mL-1（見圖 4）。

圖2 Taqman三重實時PCR對不同濃度的EIEC的擴增Fig.2 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with artificial polluted milk containing EIEC of different concentrations

圖3 Taqman三重實時PCR對不同濃度的EPEC的擴增Fig.3 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with artificial polluted milk containing EPEC of different concentrations

此外，由于通常致瀉性大腸埃希氏菌在原料乳中的數量較小，甚至達到每毫升個位的數量，所以需要對采集的原料乳進行一定時間的前增菌處理，以提高該方法于實際應用中的可行性，并且可以通過縮短增菌時間的方式，來達到快速檢測的目的。將3種原始菌體濃度均為1 cfu·mL-1的奶樣于搖床培養2 h后提取細菌基因組DNA，然后進行Taqman三重實時PCR，即可出現典型S型擴增曲線。說明該方法在2 h增菌處理后檢測限可達到 1 CFU·mL-1。

2.3 重復性檢測

表2是3種不同濃度的模板批內重復性試驗的Ct值結果。從表2可看出，雖然3組中所用DNA濃度不同，但各自擴增Ct值的SD和CV值都較低，CV值均小于5%，說明用不同濃度的DNA所做的Taqman三重熒光PCR擴增所得結果穩定可靠。在同一菌體范圍內，隨著菌體濃度的減小，SD和CV值有上升趨勢，即穩定性降低，所以在應用此方法時要盡量提高菌液濃度以減小誤差提高穩定性。

圖4 Taqman三重實時PCR對不同濃度的ETEC的擴增Fig.4 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with artificial polluted milk containing ETEC of different concentrations

表2 所建立的Taqman三重實時PCR法的批內重復性檢驗的Ct值

表3為批間重復性試驗結果，該表中顯示的CV值均在合理的范圍內（CV＜5%）。雖然EIEC的濃度比ETEC低，但Ct值是最小的，說明EIEC的擴增最為理想。

批內和批間的重復性試驗結果說明，該試驗的穩定性和重復性較好。

2.4 市售原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌的檢測

分別采用國標GB/T 4789.6-2003的方法和Taqman三重實時PCR方法檢測所采集的38份原料乳樣品，兩種方法所獲得結果高度一致：均共檢出致瀉性大腸埃希氏菌10株，其中EPEC 4株，ETEC 4株，EIEC 2株。說明本試驗所建立的Taqman三重實時PCR檢測原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌的方法準確可行，且Taqman三重實時PCR方法檢測樣品只需6 h即可完成全部過程，操作簡便，而國標GB/T 4789.6-2003方法檢測樣品需耗時4～5 d。

表3 所建立的Taqman三重實時PCR法的批間重復性檢驗的Ct值Table 3 Threshold cycle value of inter-assay of reproducibility test of Taqman triplex real-time PCR

3 討論

針對致瀉性大腸埃希氏菌的常規分離培養方法主要是指GB/T 4789.6-2003中所用方法，該方法主要分為增菌、分離、生化試驗、血清學試驗、腸毒素試驗五個部分，前后耗時約4 d，該方法的優點是結果準確可靠，可檢測出致瀉性大腸埃希氏菌的血清型，缺點是所耗時間較長，且操作繁瑣，檢測結果無法表明致病菌所攜帶的致病基因[17]。免疫學檢測方法存在與非抗原物質之間的非特異性反應，從而會產生假陽性結果，而如果待測抗原被樣品中一些物質或其他優勢菌群所掩蔽，又會產生假陰性結果。大腸桿菌的抗原很復雜，各種腸道細菌之間可能會發生基因的水平轉移，而且還存在抗原表達不完全和抗原間抑制抗原-抗體凝集反應的現象，從而影響了免疫學方法的特異性和敏感性。PCR技術因其特異性強、靈敏度高、操作簡便、所需時間短等優點，成為當前最先進、最廣泛使用的檢測技術。而加染料或探針的熒光實時PCR既保持了PCR技術靈敏、快速的特點，又克服了以往PCR技術中存在的假陽性污染和不能進行準確定量的缺點，可實現實時監控，且不需要普通PCR的后處理，極大地減少了污染的機會，同時也避免了染色劑對人體的毒害作用[9,13]。致瀉性大腸埃希氏菌包括很多致病基因，若要實現在同一個反應中將致病基因全部檢出的目的，就需要應用多重PCR技術。根據所用熒光物質的不同，熒光實時PCR技術主要分為SYBR GreenⅠ染料法、Taqman探針法和分子信標法。本文所研究的Taqman多重實時PCR技術即可在同一PCR反應管內同時檢出3種病原微生物，有效地解決了單基因PCR體系1次只可檢測1個基因型的低效缺點，具有高效、快捷、靈敏的特點。

本方法對3種致瀉性大腸埃希氏菌的檢出限均可達到102cfu·mL-1，但通常致瀉性大腸埃希氏菌在原料乳中的數量較小，能達到每毫升幾十個甚至幾個的數量，由于如果直接從所采集的樣品中提取DNA后，進行Taqman三重實時PCR擴增，勢必會造成假陰性的結果，所以需要對原料乳進行一定的增菌處理，以提高該方法于實際應用中的可行性。本研究在2 h增菌處理后可達到1 cfu·mL-1，符合致瀉性大腸埃希氏菌在原料乳中的實際存在狀況，具備實際應用價值。

張偉欽對EPEC和EIEC原始菌體濃度分別為為8.8和6.7 cfu·mL-1的兩份乳樣進行2 h的增菌處理后，進行雙重實時PCR，兩種菌均可出現擴增曲線，但Ct值要略高于本試驗[7]。Bottero等對模擬乳樣過夜增菌后，在多重PCR中加入六對引物檢測致瀉性大腸埃希氏菌的基因型，對于ETEC的st和lt的檢測限分別為 5×104和 5×106cfu·mL-1[8]，由于常規PCR較熒光PCR靈敏度不夠，同時多對引物間的競爭作用提高體系的復雜性，從而降低擴增效果，使得檢測限較高，但可看出若選擇st基因作為ETEC的目的基因，于相同條件下可相對提高檢測限。

4 結論

本研究采用已建立了反應體系和循環參數的三重實時PCR方法可快速檢測原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌，達到了一次PCR反應即可檢測3種病原菌的目的。試驗證實此方法特異性強，重復性良好，CV值均小于5%，對EIEC的檢出限可達到2.81×102cfu·mL-1，對 EPEC 的檢出限可達到2.15×102cfu·mL-1，對 ETEC的檢出限可達到 5.40×102cfu·mL-1，同時當致瀉性大腸埃希氏菌菌體濃度達到1 cfu·mL-1時，只需富集培養2 h，即可檢出陽性結果，大大提高了靈敏度，完成全部檢測過程只需大約6 h，簡便快捷，可實時監控反應進程。

[1]Nataro J P,Kaper J B.Diarrheagenic Escherichia coli[J].Clinical Microbiology Reviews,1998,11(1):142-201.

[2]陳萍,李澤鴻,邴偉.致瀉性大腸桿菌研究進展[J].上海畜牧獸醫通訊,2007(4):11-13.

[3]姚敬業,金慶.1996年發生在日本的大腸菌O157食物中毒[J].安徽預防醫學雜志,2000,6(1):79-80.

[4]陳海嬰,鄒國和,范義兵.南昌市一起腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）致感染性腹瀉病爆發的臨床與實驗室研究[J].現代診斷與治療,1999(1):83-84.

[5]王慧,胡智慧,張洪花.一起由產毒性大腸埃希菌引起的腹瀉暴發疫情[J].中國病原生物學雜志,2008,3(8):636-637.

[6]李玉鋒,代娟,康薇,等.腸毒素大腸埃希菌定時定量PCR法檢測[J].中國公共衛生,2007,23(9):1146-1147.

[7]張偉欽.Taqman雙重實時PCR快速檢測原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌方法的建立[D].哈爾濱:東北農業大學,2009.

[8]Bottero M T,Dalmasso A,Soglia D,et al.Development of a multiplexPCRassayfortheidentificationofpathogenicgenesof Escherichia coli in milk and milk products[J].Molecular and Cellular Probes,2004,18:283-288.

[9]Zhang T N,Li J C,Lu C W,et al.A multiplex PCR assay for the detection of pathogenic genes of EPEC,ETEC and EIEC[J].Journal of Northeast Agricultural University:English Edition,2006,13(1):51-54.

[10]Fu Z,Rogelj S,Kieft T L.Rapid detection of Escherichia coli O157:H7 by immunomagnetic separation and real-time PCR[J].International Journal of Food Microbiology,2005,99(1):47-57.

[11]Toma C,Lu Y,Higa N,et al.Multiplex PCR assay for identification of human diarrheagenic Escherichia coli[J].Journal of Clinical Microbiology,2003,41(6):2669-2671.

[12]Ibekwe A M,Watt P M,Grieve C M,et al.Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantifcation of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(10):4853-4862.

[13]West D M,Sprigings K A,CASSAR C.Rapid detection of Escherichia coli virulence factor genes using multiplex real-time Taqman PCR assays[J].Veterinary Microbiology,2007,122(3-4):323-331.

[14]K?ppel R,Ruf J,Zimmer F,et al.Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef,pork,chicken and turkey[J].Eur Food Res Technol,2008,227:1199-1203.

[15]Rademaker J L W,Hoolwerf J D,Wagendorp A A,et al.Assessment of microbial population dynamics during yoghurt and hard cheese fermentation and ripening by DNA population fingerprinting[J].International Dairy Journal,2006,16(5):457-466.

[16]GB/T 4789.6-2003,食品衛生微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗[M].北京:中國標準出版社,2003.

[17]付宇.原料奶中致瀉性大腸埃希氏菌的調查研究[D].哈爾濱:東北農業大學,2009.