轉谷氨酰胺酶催化對大豆分離蛋白凝膠性的影響

于國萍，安 靜，初云斌，韓宗元，李 巖，姜巍巍

（東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030）

大豆是一種重要的經濟作物，是我國當前農業生產與食品加工重點發展目標之一[1]。其中大豆蛋白是大豆中最重要的成分，它已作為一種組分應用于各種食品中。大豆蛋白產品的溶解性、保水性、吸水性，是大豆蛋白產品能夠在食品中很好應用的重要基礎之一[2]。從國際食品業的發展趨勢看，大豆食品產業即將成為21世紀促進人類健康的基本保健食品和主流食品。

大豆分離蛋白（Soybean protein isolated,SPI）網絡結構和凝膠的形成過程受鹽濃度、pH及溫度等因素的影響。Braga等研究發現，蛋白質網絡結構的形成是由于蛋白質-蛋白質和蛋白質-水之間的相互作用平衡以及相鄰多肽鏈之間吸引力和排斥力共同作用的結果[3]。在熱誘導大豆蛋白凝膠形成的過程中，涉及的分子作用力可能是氫鍵、疏水性相互作用，而維持凝膠結構時可能的作用力是二硫鍵和氫鍵[4]。

轉谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase）是一種能催化多肽或蛋白質的谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團（酰基供體）與許多伯胺化合物（酰基受體）之間的酰基轉移反應的酶。轉谷氨酰胺酶的添加，提高了大豆分離蛋白的凝膠能力及性能。國外的轉谷氨酰胺酶交聯的高蛋白產品在市場已廣泛存在[5]。

本文以大豆分離蛋白為原料，系統地研究了轉谷氨酰胺酶處理的大豆蛋白凝膠形成機理以及對大豆分離蛋白凝膠強度、保水性和表面疏水性的影響，了解其變化規律，尋找其可能的變化機理，為改進我國大豆蛋白的功能性和應用價值提供參考，從而獲得不同質構的大豆蛋白凝膠產品。對食品加工業也具有積極的指導意義，解決了食品加工中存在的難題，明顯改善食品品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

1-苯胺基萘-8-硝基苯甲酸鹽（ANS），Tris，甘氨酸，過硫酸氨，TEMED（購自Sigma公司）；大豆分離蛋白（購自哈高科大豆食品有限責任公司）。其余所用試劑均為國產分析純。

1.1.2 酶制劑

轉谷胺酰胺酶（TG-B）（952 U·g-1），購自一鳴生物制品有限公司。

1.1.3 儀器

TA-XT plus物性測定儀（購自英國Stable Micro System公司）；熒光分光光度計（HITACHI 650-60）（購自日本島津公司）；掃描電鏡（購自日本日立公司）；實驗室pH計（購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；HJ-3恒溫磁力攪拌器（購自江蘇金壇市中大儀器廠）；離心機（購自北京醫藥離心機廠）。

1.2 方法

1.2.1 轉谷氨酰胺酶催化條件下制備大豆分離蛋白凝膠

1.2.1.1 不同加酶量對大豆分離蛋白凝膠的影響

配制13%（W/V）大豆分離蛋白分散液，調pH 7.5，添加 TGase 量分別為 0、10、20、30、40、50、60 U·g-1蛋白，反應物于40℃下反應0.5 h。

制膠條件：將樣品在90℃加熱40 min。然后，用冰水浴將凝膠迅速冷卻至室溫。最后，將樣品置于4℃冰箱過夜，用于凝膠性質的測定。

1.2.1.2 不同反應溫度對大豆分離蛋白凝膠的影響

配制13%（W/V）大豆分離蛋白分散液，調pH到7.5，添加TGase量40 U·g-1，反應物于30、40、50、60、70℃下反應0.5 h。按1.2.1.1的制膠條件，制備凝膠。

1.2.1.3 不同pH對蛋白的影響

配制13%（W/V）大豆分離蛋白分散液，調pH 5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，添加 TGase 量 40 U·g-1，反應物于40℃下反應0.5 h。按1.2.1.1的制膠條件，制備凝膠。

1.2.1.4 不同反應時間對蛋白的影響

配制13%（W/V）大豆分離蛋白分散液，調pH到7.5，添加TGase量40 U·g-1，反應物于40℃下分 別 反 應 0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3、 3.5 h。 按1.2.1.1的制膠條件，制備凝膠。

1.2.2 轉谷氨酰胺酶的二次回歸正交旋轉組合試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，確定了試驗各因素的水平設置范圍，進行多因素試驗。采用二次回歸正交旋轉組合設計方法（響應面法），選擇酶添加量、溫度、pH、作用時間4個變量組成操作參數集合。以凝膠強度為考察指標，采用Design Expert7.0軟件建立數學模型，尋找轉谷氨酰胺酶催化改性大豆分離蛋白凝膠強度取得最大值的條件，因素水平見表1。

表1 轉谷氨酰胺酶的二次旋轉正交設計因素水平編碼Table 1 Level and factor design of square rotation cross-regression experiments(TGase)

1.2.3 蛋白凝膠的凝膠強度的測定

測定方法依據Gu等[6]，略有改動。樣品測定前在室溫下陳化1 h即可測定。凝膠大小約為50 mm（直徑）×25 mm（高）。采用P/0.5柱形探頭,設定前進速度10 mm·s-1，沖壓速度10 mm·s-1；后撤速度10 mm·s-1，沖壓深度10 mm；一次測定過程中探頭下壓兩次。每個樣品重復3次測定過程，取平均值，得凝膠質構參數。

1.2.4 蛋白凝膠的表面疏水性的測定[7-8]

取一塊大豆蛋白凝膠，加入到0.01 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液中，在室溫下，用磁力攪拌器緩慢的攪拌2 h。然后，將處理過的樣品在9 000 r·min-1下離心15 min。取上清液備用。采用ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸）熒光探針法，對大豆分離蛋白凝膠的表面疏水性指數進行測定，具體方法見文獻[8]。

1.2.5 蛋白凝膠的保水性的測定

測定方法依據Gu等[6]，略有改動。大豆蛋白凝膠在 9 000 r·min-1下離心 20 min。保水性（WHC）公式如下：

式中，Wt-凝膠樣品中所含水分的總重（g），Wr-離心后凝膠溢出水分的重量（g）。

1.2.6 SPI及其凝膠的SDS-PAGE電泳分析

把SPI和從SPI凝膠中提取出的蛋白作為樣品，加入到樣品緩沖液（0.5 mol·L-1Tris-HCl（pH 6.8）2 mL，甘油 2 mL，20%（W/V）SDS 2 mL，0.1%（W/V）溴酚藍0.5 mL、β-巰基乙醇1 mL、重蒸水2.5 mL）中，最終蛋白濃度是 1 mg·L-1。標準蛋白質Marker分子質量14 400～97 400 u。在80和120 V下，濃縮膠（4%）和分離膠（14%）進行電泳試驗。考馬斯亮藍（R-250）染色液染色。然后用脫色液（冰醋酸75 mL和甲醇50 mL，定容到1 000 mL）脫色。

1.2.7 掃描電鏡分析（Scanning electron microscopy，SEM）[10]

測定方法參照文獻[9]。

1.2.8 統計分析

每次試驗重復3次。所用數據均為3次的平均數，誤差項為標準差；數據肩標有相同字母者為差異不顯著（P＞0.05），有不同字母者為差異顯著（P＜0.05）。文中數據均使用SPSS13.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 轉谷氨酰胺酶催化對大豆分離蛋白凝膠性的影響

2.1.1 酶添加量對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

結果表明，隨著加酶量的增加，凝膠強度顯著增加；加酶量在40 U·g-1時，凝膠強度達到最大；隨著加酶量繼續增加，凝膠強度有所下降（見圖1）。

圖1 酶添加量對TGase催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.1 Effect of enzyme additives on gel hardness of TGase-SPI gel

在本試驗中，轉谷氨酰胺酶（TGase）濃度升高到40 U·g-1時，蛋白質的凝膠強度達到最大值，說明添加TGase對SPI凝膠強度有很明顯的改善作用，此時維系蛋白質凝膠網絡穩定所需的共價鍵的數目具有一定的飽和性。蛋白質分子表面的作用位點一定，過量的酶的添加，已沒有足夠的蛋白底物與之反應，使凝膠強度在達到最高點后趨于穩定。

2.1.2 溫度對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

結果表明，隨著酶反應溫度的增加，凝膠強度顯著增加；在40～60℃，沒有顯著變化；在70℃時，凝膠強度顯著下降（見圖2）。

圖2 溫度對TGase催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.2 Effect of temperature on gel hardness of TGase-SPI gel

溫度一方面影響酶反應的速度，另一方面影響酶活性。唐傳核等報道，TGase的最適反應溫度為50～55℃[10]。Ando等曾報道，以氧肟酸為底物時，微生物TGase在pH 7.0時，酶的最適反應溫度為40℃[11]。本試驗與上述結論基本相符合。較高的溫度下交聯反應速度很快，使得蛋白質分子表面的作用位點很快被交聯而降低了此蛋白質分子與其周圍蛋白質分子進行分子間交聯的機率，因而分子間的交聯所占比例下降[12,12-13]。

2.1.3 pH對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

結果表明，隨著pH的增加，凝膠強度顯著增加；當pH 7.5時，凝膠強度最高；之后，隨著pH的繼續增加，凝膠強度顯著下降（見圖3）。

圖3 pH對TGase催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.3 Effect of pH on gel hardness of TGase-SPI gel

體系pH改變一方面影響酶活性和穩定性，TGase的最適pH范圍是6.0～7.5；另一方面影響SPI的溶解性，影響蛋白質相互作用過程中的疏水作用和靜電作用之間的平衡，進而影響凝膠的網狀結構。在極高pH下，酶蛋白不穩定發生空間構象改變而喪失活性；而pH處于SPI的等電點附近時，蛋白質分子所帶凈電荷較少，易凝結成塊，無法形成有序的網狀結構[14-15]。

2.1.4 作用時間對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

結果表明，隨著反應時間的增加，凝膠強度顯著增加；在2.5 h時，凝膠強度達到最大；之后，呈現下降趨勢（見圖4）。

圖4 作用時間對TGase催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.4 Effect of time on gel hardness of TGase-SPI gel

反應時間也是影響酶促反應的重要因素，因此對SPI的凝膠性也必然產生較大的影響。

2.2 轉谷氨酰胺酶（TGase）的二次回歸正交旋轉組合試驗設計

2.2.1 TGase催化SPI凝膠強度的二次回歸正交旋轉組合試驗設計結果

在單因素試驗結果的基礎上，依據表1的因素水平，得出試驗設計方案及結果（見表2）。

表2 TGase催化SPI凝膠強度的試驗設計方案和試驗結果Table 2 Design and result of square rotation cross-regression experiments of TGase-gel hardness

續 表

2.2.2 TGase催化SPI凝膠強度的逐步回歸模型

以酶添加量（A）、溫度（B）、pH（C）、作用時間（D）4個因素為自變量，以凝膠強度（g）為響應值，根據表2中的試驗結果，運用Design-Expert7.0軟件對其進行回歸擬合，并去除不顯著項，得到操作參數對凝膠強度的回歸方程為：

凝膠強度（g）=150.39+4.81×A+4.97 B+5.38×C+3.16×A×C+4.31×A×D-8.40×B×D+4.27×C×D-11.64×A2-12.53×B2-17.17×C2-7.38×D2

同時得到方差分析表3。

表3 TGase催化SPI凝膠強度的方差分析

續 表

通過對凝膠強度回歸模型進行顯著性檢驗，其F 值=40.07，概率（Pr＞F）值=＜0.0001，說明凝膠強度的回歸模型顯著，回歸方程確定系數R2為0.9740，表明模型擬合度較好。由回歸分析可知，轉谷氨酰胺酶的交互作用AC（酶添加量-pH）、AD（酶添加量-作用時間）、BD（溫度-作用時間）、CD（pH-作用時間）對大豆分離蛋白凝膠強度的影響是顯著的。分析出最佳條件為：酶添加量40 U·g-1、溫度40℃、pH 7.5、作用時間2.5 h。此時，大豆分離蛋白最大凝膠強度為156.699 g。進行驗證試驗，實測值為（150.547±6.374）g。

2.2.3 具有顯著交互作用的因素對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

2.2.3.1 酶添加量-pH的交互作用對轉谷氨酰胺酶催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響

結果如圖5所示。

圖5 酶添加量-pH的交互作用對TGase催化SPI凝膠強度的影響Fig.5 Effect of interaction effect of enzyme additives and pH on TGase-gel hardness

在溫度40℃和作用時間2.5 h時，研究pH和作用時間的交互作用對凝膠強度的影響。當酶添加量一定時，凝膠強度隨著pH的增加逐漸增大；當pH 7.5時，達到最大；之后，呈現下降趨勢。當pH一定時，凝膠強度隨著酶添加量的增加逐漸增大；當酶添加量40 U·g-1時，達到最大；之后，呈現下降趨勢。說明酶添加量和pH對凝膠強度的變化起到了較大作用。在pH 7.5、酶添加量40 U·g-1時，凝膠強度最大。

2.2.3.2 溫度-作用時間的交互作用對轉谷氨酰胺酶催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響

結果見圖6。

圖6 溫度-作用時間的交互作用對TGase催化SPI凝膠強度的影響Fig.6 Effect of interaction effect of temperature and time on TGase-gel hardness

響應面分析結果表明，在pH 7.5和酶添加量40 U·g-1時，研究溫度和作用時間的交互作用對凝膠強度的影響。當作用時間一定時，凝膠強度隨著溫度的增加逐漸增大；當溫度40℃時，達到最大；之后，呈現下降趨勢。當溫度一定時，凝膠強度隨著作用時間的增加逐漸增大；當作用時間2.5 h時，達到最大；之后，呈現下降趨勢。說明作用時間和溫度對凝膠強度的變化起到了較大作用。在作用時間2.5 h、溫度40℃時，凝膠強度最大（見圖 6）。

2.3 轉谷氨酰胺酶催化前后蛋白凝膠的電泳圖譜

結果見圖7。

由圖7可知，加入轉谷氨酰胺酶后,由于TGase對大豆蛋白交聯聚合作用，使聚合物分子量增大，以至于不能全部進入分離膠，而部分蛋白只能停留在濃縮膠與分離膠的界面上，即圖中頂端電泳區帶。經電泳后，7S的3個亞基和11S的酸性亞基（A）條帶色澤變淡或消失，說明二者聚合生成了大分子蛋白聚合物。而大豆11S蛋白的堿性亞基（B）在各加酶量條件下幾乎都沒有明顯的變化，說明TGase對11S堿性亞基幾乎沒有影響，可能是因為11S的堿性亞基被深深地包在大豆球蛋白的內部，很難與TGase結合形成活化復合物。

圖7 轉谷氨酰胺酶催化后蛋白凝膠的電泳圖譜Fig.7 SDS-APGE of soybean protein modification

2.4 轉谷氨酰胺酶催化前后對大豆分離蛋白凝膠特性的影響

結果見圖8、9。

由圖8、9可以看出，轉谷氨酰胺酶催化后大豆分離蛋白凝膠強度顯著增加，而表面疏水性和保水性卻有所下降。

圖8 轉谷氨酰胺酶催化前后對大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.8 Effect of TGase on gel hardness of SPI gel

圖9 轉谷氨酰胺酶催化前后對大豆分離蛋白凝膠表面疏水性和保水性的影響Fig.9 Effect of TGase on surface hydrophobicity and water-holding capacity of SPI gel

2.5 掃描電鏡觀察TGase催化的大豆分離蛋白凝膠的微觀結構

如圖10所示，TGase催化的大豆分離蛋白凝膠，較對照組凝膠網絡結構非常致密，凝膠網絡結構分布非常均勻。

圖10 TGase催化的大豆分離蛋白凝膠的微觀結構Fig.10 Micro-structure of TGase-SPI gel observed by scanning electron microscopy

3 討論與結論

轉谷氨酰胺酶的添加，提高了大豆分離蛋白的凝膠能力及性能，適度酶解導致的蛋白中疏水基團的暴露有利于在較低的蛋白濃度下形成網絡組織結構。TGase催化SPI形成凝膠的主要作用是分子交聯形成的空間網絡結構[13-15]。

MTGase催化大豆蛋白溶解性下降。SDSPAGE分析可知，MTGase的作用形成了較大的共價聚合物，親水性基團因相互聚合而減少，這對溶解性的下降起一定的作用。經MTGase催化，SPI溶解度下降，所以凝膠表面疏水性和保水性下降。

轉谷氨酰胺酶能夠顯著的提高了大豆分離蛋白凝膠的凝膠強度。最佳工藝條件為：酶添加量40 U·g-1、溫度40℃、pH 7.5、作用時間2.5 h。加入酶 后 ， 凝 膠 強 度 由（67.185±1.028）g 增 加 到（150.547±6.374）g。但此時凝膠表面疏水性指數顯著下降，由（406.73±11.86）降低到（181.69±3.06）；凝膠保水性有所下降，由97.33%±0.66%降低到90.93%～3.45%。

[1]趙新淮,鄭秋鹛,李友華.國外大豆蛋白的生產、特性和應用概況[J].東北農業大學學報,2003,34(3):344-351.

[2]劉宏芳,侯瑤,趙新淮.大豆蛋白限制性酶解修飾與產品的溶解性和保水性變化[J].東北農業大學學報,2009,40(1):97-103.

[3]Braga A L M,Azevedo A,Marques M J,et al.Interactions between soy protein isolate and xanthan in heat-induced gels:The effect of salt addition[J].Food Hydrocolloids,2006,20:1178-1189.

[4]UtsumiS,KinsellaJE.Forcesinvolvedinsoyproteingelation:Effects of various reagents on the formation,hardness and solubility of heat-induced gels made from 7S,11S and soy isolate[J].Journal of Food Science,1985,50:1278-1282.

[5]Gan C Y,Cheng L H,Easa A M.Physicochemical properties and microstructures of soy protein isolate gels produced using combined cross-linking treatments of microbial transglutaminase and Maillard cross-linking[J].Food Research International,2008,41:600-605.

[6]Gu X,Campbell L J,Euston S R.Influence of sugars on the characteristics of glucono-δ-lactone-induced soy protein isolate gels[J].Food Hydrocolloids,2009,23:314-326.

[7]Campbell L J,Gu X,Dewer S J,Euston S R.Effects of heat treatment and glucono-δ-lactone-induced acidification on characteristics of soy protein isolate[J].Food Hydrocolloids,2009,23:344-351.

[8]Hettiarachchy N S,Kalapathy U,Myers D J.Alkal-modified Soy proteins with improved adhesive and hydrophobic properties[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1995,72(12):1461-1464.

[9]Chin K B,Go M Y,Xiong Y L.Effect of soy protein substitution for sodium caseinate on the transglutaminate-induced cold and thermal gelation of myobrillar protein[J].Food Research International,2009(1):1-8.

[10]唐傳核,楊曉泉,彭志英,等.微生物轉谷氨酰胺酶催化大豆11S球蛋白聚合研究[J].食品科學,2002,23(3):42-46.

[11]Ando H,Adachi M,Umeda K,et al.Purification and characteristics of a novel trans-lutaminase derived from microorganisms[J].Agric Biol Chem,1989,53:2613-2617.

[12]姜燕,溫其標,唐傳核.微生物谷氨酰胺轉移酶對大豆分離蛋白凝膠性能的影響[J].食品工業科技,2006,27(5):59-62.

[13]田少君,梁華民.轉谷氨酰胺酶對大豆分離蛋白的改性研究[J].糧油加工與食品機械,2005(6):54-59.

[14]袁道強,楊麗.改性對大豆分離蛋白凝膠性的影響[J].食品科技,2007,14(2):21-23.

[15]鄭雅丹,張建友,丁玉庭,等.大豆蛋白凝膠特性研究進展[J].中國釀造,2008,191(14):1-15.