捻轉血矛線蟲H11蛋白提取及其氨肽酶活性分析

趙媛媛，韓彩霞，李曉云，宋銘忻，路義鑫

（東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030）

捻轉血矛線蟲（Haemonchus contortus）是圓線目，毛圓科，血矛屬線蟲，主要寄生于牛羊等反芻動物皺胃黏膜，偶見小腸中，因吸血導致宿主貧血、消瘦，嚴重的可引起幼畜尤其是羔羊大批死亡，死亡率可高達30%以上，給畜牧業造成巨大的經濟損失[1]。目前主要采用化學藥物治療該病，但藥物殘留嚴重，如多拉菌素藥物殘效期為50 d[2]，加之抗藥性蟲株的出現和蔓延，使得傳統的治療受到嚴重挑戰，迫切需要一種有效的防治方法以控制其感染和流行，對疫苗的開發研制成為捻轉血矛線蟲病防治研究中的熱點。

捻轉血矛線蟲H11蛋白是一種分子質量在110 ku的完整膜糖蛋白復合物，為現今疫苗最佳候選抗原，具有很好的免疫效果，其僅在L4期幼蟲和成蟲小腸微絨毛上表達，可引起與血清抗體有關的高水平的保護作用。天然H11免疫動物后，可使雄蟲減少70%、雌蟲減少80%、蟲卵減少90%，且對不同年齡階段的綿羊均具有保護作用，且其保護率與抗體水平也呈正相關[3]。由于原核系統對表達產物的翻譯后加工、修飾、糖基化等作用不能達到真核系統的要求，其重組形式僅能提供很小的免疫保護，免疫效果遠不及天然抗原。為了能夠對H11蛋白有進一步的了解，本試驗對體外培養的L4期幼蟲和自然感染的成蟲的H11天然蛋白分別進行了提取和純化，并進一步測定其酶活性及酶抑制劑敏感性，為利用天然抗原進行疫苗研制進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 捻轉血矛線蟲成蟲

采于自然感染的山羊皺胃，經形態學特征鑒定為捻轉血矛線蟲雌性成蟲。

1.1.2 捻轉血矛線蟲L4期幼蟲

采用體外培養法獲得捻轉血矛線蟲L4期幼蟲[4]。

1.2 方法

1.2.1 捻轉血矛線蟲H11蛋白的提取

自然感染的成蟲蟲體與離體培養至L4晚期的蟲體的H11蛋白的提取方法相同。將蟲體用PBS徹底清洗干凈，放入大約和蟲體等重的含0.02%疊氮化鈉的PBS（PBS/a）中，-20°C保存備用。

取蟲體15～25 g，在少量PBS/a中用剪刀剪碎，然后加入約10倍蟲體體積的冰預冷的PBS/a在勻漿器里進行組織勻漿，勻漿液15 000 r·min-1離心。棄掉上清液（包含大量捻轉素和其他鹽溶性蛋白質），沉淀用PBS/a再次重懸后離心。為了去除沉淀表面的膜蛋白和殘留的捻轉素，將沉淀在PBS/a中用1%Tween 20萃取，并于冰水混合物中靜置1 h，然后10 000 r·min-1離心棄上清。所得沉淀在PBS/a中用1%Thesit（Polyoxyethylene 9 lauryl ether，Boehringer mannheim gmbH）或TritonX-100以同樣步驟萃取4次，所得上清濃縮備用。

1.2.2 捻轉血矛線蟲H11蛋白的純化

將上述獲得的上清液裝入透析袋，外加聚乙二醇覆蓋即撒在透析袋外置于4℃下，透析好后-20℃保存備用。

在對含H11蛋白的溶液純化之前所要用的緩沖液先用PDl0柱更換成含下述成分的溶液，5 mmol·L-1CH3COONa，pH 5.2，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1CaCl2，1 mmol·L-1MnCl2，0.02%NaN3包含0.1%Thesit（Con A buffer）。先用1 mol·L-1NaCl和0.1 mol·L-1NaCl充分洗滌Con A柱，再把用PDl0柱更換的緩沖溶液加入到伴刀豆球蛋白A-交聯結合的瓊脂糖柱上，流洗5～10個柱床體積平衡柱子備用。

將濃縮后的蛋白樣品加至Con A凝集素親和瓊脂糖柱上，4℃旋轉反復循環上柱以保證樣品充分吸附后，平衡緩沖液流洗10個柱床體積（流速0.10 mL·min-1），至吸收峰 280 nm降至基線后，500 mmol·L-1的α-D-吡喃葡萄糖苷開始洗脫（流速0.10 mL·min-1），每管收集1 mL，至吸收峰280 nm降至0.1以下終止洗脫，收集各管洗脫液，每管各取50 μL進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.3 測定H11蛋白的氨基肽酶活性

1.2.3.1 氨肽酶M(ApM)活性測定

用250 μL HEPES（羥乙基哌嗪乙磺酸，50 mmol·L-1，pH 7.4）分別溶解 1、2、4、8、16、32 μg成蟲H11蛋白和L4 H11蛋白，于37℃保溫10 min 后，加入 10 μL 底物（25 mmol·L-1L-亮氨酸-P-硝基苯胺），于37℃反應15 min后，分別測定其D405值。

1.2.3.2 氨肽酶A(ApA)活性測定

方法同氨肽酶M（ApM）活性測定，底物為25 mmol·L-1L-谷氨酸-P-硝基苯胺。

1.2.4 H11氨基肽酶酶抑制劑敏感性

取成蟲及L4期幼蟲H11蛋白各8 μg溶解于250 μL HEPES 緩沖液（50 mmol·L-1，pH 7.4）中，分別加終濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.2 mg a.i.·L-1的蛋白酶抑制劑：EDTA、鄰二氮雜菲，37℃保溫10 min后加10 μL底物（同氨基肽酶活性測定），37℃反應15 min，分別測定D405值。

2 結果與分析

2.1 H11蛋白的提取與純化

SDS-PAGE結果表明，用PBS和1%Tween預提取后再用1%Thesit提取整個蟲體，如圖1所示，泳道1最上面的箭頭所示條帶為成蟲H11蛋白，H11下面的條帶為蟲體雜蛋白。泳道2箭頭所示為L4體內H11蛋白。泳道3箭頭所示為捻轉素，分子質量為56 ku，富含H11的條帶中沒有捻轉素。

H11蛋白（抗原）是捻轉血矛線蟲成蟲消化過程中所必需的一種酶類。由圖1可知，H11蛋白在體外培養的L4期幼蟲體內也有表達，可能是因為L4期幼蟲已經開始利用形成的口囊從體外獲取血源物質，并利用此蛋白作為消化酶進行消化，以此來獲取蟲體進一步成長發育的營養物質。

純化的H11蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果如圖2所示。在蟲體用量相同的情況下，L4期幼蟲H11蛋白經ConA凝集素親和瓊脂糖柱后，收集各管洗脫液，所跑條帶不明顯，需要在ConA柱上再純化一遍，但條帶仍較成蟲條帶窄、顏色淺。用紫外分光光度計分別測定純化的成蟲及L4晚期幼蟲體內H11蛋白濃度，測定其OD260和OD280值，以稀釋液作為空白對照，測定結果為15 g成蟲和15 g L4期幼蟲體內H11蛋白含量分別為0.59和0.28 mg。

由此可知，H11蛋白主要存在于成蟲體內，原因可能是由于成蟲蟲體大，吸血多，發育完全，而L4期幼蟲在體外只靠吸血獲得營養物質，蟲體似乎不能完成L4至成蟲的發育，表明皺胃內容物及皺胃粘膜中的某些成份也是蟲體生長發育必不可少的營養物質。L4體內的H11蛋白含量少，且較成蟲提取步驟繁瑣。因此對L4期幼蟲的體外培養還需進一步的研究，以盡早得到在體外培養條件下使L4幼蟲發育到成蟲的培養系及培養條件。

2.2 酶活性測定

2.2.1 氨肽酶M（ApM）活性分析

測定不同含量的成蟲H11蛋白和L4 H11蛋白對底物L-亮氨酸-P-硝基苯胺的酶促反應速度關系。結果如圖3所示，兩組蛋白都能對底物L-亮氨酸-P-硝基苯胺有酶解能力，且D405值隨著蛋白量的增加而增加，H11-成蟲比H11-L4活性稍高，其D405值可達0.35左右。

圖3 H11蛋白量與酶促反應速度關系Fig.3 Relationship of H11 proteins concentration with enzymatic reaction velocity

2.2.2 氨肽酶A（ApA）活性分析

測定不同含量的成蟲H11蛋白和L4幼蟲H11蛋白對底物L-谷氨酸-P-硝基苯胺的酶促反應速度關系。結果如圖4所示，兩組蛋白都能對底物L-谷氨酸-P-硝基苯胺有酶解能力，且D405值隨著蛋白量的增加而增加，H11-成蟲比H11-L4活性稍高，其D405值可達0.36左右。

圖4 H11蛋白量與酶促反應速度關系Fig.4 Relationship of H11 proteins concentration with enzymatic reaction velocity

總之，酶活性測定結果表明，兩組蛋白都能對合成底物L-亮氨酸-P-硝基苯胺和L-谷氨酸-P-硝基苯胺有酶解能力，且D405值隨著蛋白量的增加而增加，說明H11作為氨肽酶既具有氨肽酶M（ApM）活性也具有氨肽酶A（ApA）活性，H11-成蟲比H11-L4活性稍高，其D405值可達0.35～0.36。

H11蛋白作為寄生階段捻轉血矛線蟲小腸微絨毛上皮細胞中的一種跨膜糖蛋白，具有氨基肽酶活性，這是H11之所以具有較好的免疫保護作用的主要原因[5]。H11-成蟲比H11-L4的氨肽酶活性稍高，可能是由于蟲體發育程度的差異，成蟲蟲體大，吸血量大，體內H11含量較L4多，進一步表明H11的氨肽酶活性可能存在階段性表達。

2.3 H11蛋白酶抑制劑敏感性測定

測定兩組H11蛋白對酶抑制劑的敏感性表明，H11-成蟲、H11-L4對非特異性蛋白酶抑制劑EDTA和哺乳動物氨肽酶抑制劑鄰二氮雜菲均敏感（見圖5、6），且D405值隨著酶抑制劑的增加而減少，H11-成蟲比H11-L4敏感性稍高，兩組蛋白對鄰二氮雜菲較EDTA更為敏感。

EDTA是非特異性蛋白酶抑制劑，EDTA能與酶活性中心的金屬離子鰲合抑制蛋白酶的活性。有試驗結果可知，EDTA對氨基肽酶活性有抑制作用，所以分析可得，該酶是金屬依賴性酶類。H11對哺乳動物氨肽酶抑制劑鄰二氮雜菲均敏感，H11對氨肽酶A和氨肽酶M在同源性上均有一定的相似，大約有30%的氨基酸一致，這表明與哺乳動物氨肽酶保守區域周圍位點有很高水平的同一性。

3 討論與結論

H11蛋白是寄生階段捻轉血矛線蟲小腸微絨毛上皮細胞中的一種跨膜糖蛋白，具有氨基肽酶活性，氨基肽酶是成蟲消化過程中必須的一種酶類，由于成蟲蟲體大，吸血多，發育完全，通過對L4及成蟲體內H11的純化及含量測定可以看出，與成蟲相比L4期幼蟲體內H11含量少（約不到成蟲的一半），而且較成蟲H11蛋白提取步驟繁瑣，存在一定難度。可見捻轉血矛線蟲H11蛋白的提取純化還需進一步的研究，以盡早得到在體外培養條件下使L4幼蟲發育到成蟲的培養系及培養條件。

H11之所以具有較好的免疫保護作用，Smith等認為，該抗原（氨基肽酶）是成蟲消化過程中所必需的一種酶類，成蟲吸血后，血液中抗H11抗體與捻轉血矛線蟲微絨毛上的H11結合，使得該酶活性降低或喪失[5]。因為雌蟲蟲體較雄蟲大，吸血多，抗H11抗體也多，所以其代謝受到的影響大。由H11天然蛋白的免疫保護結果可以看出，雌蟲減少率高于雄蟲，蟲卵減少率高于雌蟲和雄蟲。Clare等在研究瘧疾時發現，氨基肽酶抑制劑能有效抑制Plasmodium falciparum的生長發育，并推測氨基肽酶在分解血紅蛋白多肽中發揮重要作用[6]。

對L4幼蟲及成蟲H11蛋白的氨基肽酶活性分析表明，H11天然蛋白同時具有氨肽酶M活性和氨肽酶A活性。在測定H11蛋白的活性時發現，H11-成蟲的酶活性比H11-L4稍高。由于試驗沒有氨基肽酶陽性對照，H11蛋白的酶促動力學常數無法給出，只能定性地反映氨肽酶活性。

對H11酶抑制劑敏感性測定得出EDTA和鄰二氮雜菲對其酶活性均有抑制作用。H11是一種功能性酶，它的氨肽酶M（ApM）是鋅結合的金屬酶類，對N端殘基二肽有比較寬泛的專一性，EDTA是非特異性蛋白酶抑制劑，能與酶活性中心的金屬離子鰲合。本試驗中EDTA對氨基肽酶活性有抑制作用，證明該酶是金屬依賴性酶類。因H11對EDTA等敏感，在提取過程中要注意避免接觸此類物質以防蛋白變性。氨肽酶A（ApA）是鈣結合的酶類，優先分解以酸性氨基酸為殘基的底物。H11對哺乳動物氨肽酶抑制劑鄰二氮雜菲均敏感，H11對氨肽酶A和氨肽酶M在同源性上均有一定的相似，大約有30%的氨基酸一致，這表明與哺乳動物氨肽酶保守區域周圍位點有很高水平的同一性。Munn等使用十二烷基磺酸鈉（SDS）和二硫蘇糖醇（DTT）處理H11，改變H11的天然構象，再分別免疫綿羊，發現蟲卵減少率分別為85%、79%，成蟲減少率分別為79%、54%，說明H11變性后，仍有較強的免疫保護作用，從而證明H11存在大量線性化的抗原表位[7]。但變性后的H11與天然H11相比，蟲卵和成蟲減少率均有所下降，這表明H11不僅存在大量線性化的抗原表位，且具有一些構象依賴性抗原決定簇。

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