番茄Mi-1基因的SNP分型

李亞玲，李景富，康立功，張 賀，董曉慧，許向陽*

（1.東北農業大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農業科學院綏化分院，黑龍江 綏化 152052）

單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism,SNP）是指染色體基因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態性，而其中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1%[1-2]，其中包括單堿基的轉換（包括C與T轉換，在其互補鏈上則為G與A互換）、顛換（包括C與A、G與T、C與G，A與T互換），以及單堿基的插入/缺失等。通常所說的SNP并不包括后兩種情況，轉換的發生率也總是明顯高于其他幾種變異，可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而成為胸腺嘧啶[3-4]。SNP被稱為繼限制性片段長度多態性（Restriction fragment length polymor-phisms,RFLP）以及微衛星多態性（Micro-satellite polymorphisms）等標記之后的第三代分子標記。

SNP檢測分析技術目前主要有陣列雜交分析（Array hybridization assays），基因芯片技術（Gene chips），同源雜交（Homogenous hybridization），限制性酶切法，直接測序法（Direct sequencing）。直接測序檢測SNP的基本原理是：通對不同個體同一基因或基因片段進行測序和序列比較,以確定所研究的堿基是否變異,其檢出率可達100%[5]，本試驗中的SNP位點即通過直接測序法獲得。

SNP分型是SNP研究領域的重要課題。根據不同研究需要和試驗條件，已建立了不同的分型方法，包括寡核苷酸連接分析[6-7]、質譜法以及基于PCR的等位基因特異性 PCR（AS-PCR）等[8]。ASPCR法通過特異引物的巧妙設計，PCR對DNA基因組信息的放大和合適的檢測方法將不同的SNP基因型分辨開來，具有費用低，程序簡單，易于操作等優點，適于中小型研究單位對較小規模SNP檢測[9]。目前，改良的AS-PCR方法已有較多報道，如片段長度差異等位基因特異性 PCR（FLDASPCR）、四引物擴增受阻突變體系PCR技術等[10-11]。

本研究試圖建立和優化適合于番茄Mi-1基因SNP分型的AS-PCR反應體系，提高這種分型技術在番茄SNP分型中的準確性，為番茄的抗根結線蟲Mi基因分子標記連鎖作圖打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試番茄材料

抗病親本08576、感病親本T431以及08576和T431有性雜交的F2代單株。上述材料均由東北農業大學園藝學院番茄課題組提供。通過對這些種質根結線蟲Mi-1基因的序列分析，篩選出候選的SNP位點。

1.1.2 供試試劑

CTAB、EDTA、RNase、TaqDNA聚合酶（均購于IBM公司）；Repel、Binding（北京鼎國生物技術公司生產）；DNA Marker、dNTP、引物（由上海生工生物工程和大連生物公司合成或生產）；其他試劑如瓊脂糖、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇、溴化乙錠、TAE緩沖液等化學試劑（由哈爾濱市寶瑞生物試劑公司和哈爾濱市德美試劑公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取番茄植株幼嫩葉片，用自來水、蒸餾水沖洗兩遍，用滅菌后的濾紙吸干后，每個樣本稱取0.2 g裝入1.5 mL離心管中，用液氮速凍后-20℃保存備用；采用CTAB法對番茄抗病親本品種08576和感病親本品種T431以及雜交組合的F2代分離群體各單株分別進行DNA提取。

DNA濃度和質量的測定：用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，λDNA作為Marker，以檢查DNA濃度；紫外分光光度計測定樣品的純度，OD260/OD280=1.7～2.0。

1.2.2 等位基因PCR（Allele specific polymerase chain reaction，AS-PCR）

1.2.2.1 引物設計

他們好像不是在分手，為什么這么風輕云淡，沒有大吵大鬧，沒有歇斯底里，沒有爭吵推諉，或者他們都在等對方先說出來，其實心里早已經對這段感情沒有了信心。

試驗采用的是原試驗數據中一個位于雙親測序片段401 bp的A-T型顛換的SNP突變位點，研究采用了2個平行擴增反應，篩選了3個引物，除都有1個共同上游引物外，另外2個特異下游引物3′末端堿基分別和SNP正常堿基和突變堿基互補，在其3′末端第二或第三堿基分別引入錯配堿基增加特異性，引物長度約18～20 bp。用Primer Premier 5軟件和Oligo6軟件相結合，設計Mi基因特異引物，優化DNA模板濃度梯度、退火溫度梯度、引物濃度梯度、dNTP濃度梯度、Mg2+濃度梯度，摸索出擴增效果最佳的PCR程序。

1.2.2.2 PCR擴增

PCR 反應體系為 20 μL，10×buffer 2 μL，引物各 1.5 μL，2 mmol·L-1dNTP 1 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.5 μL，DNA 模板 1 μL，5 U·μL-1Taq 酶 0.2 μL。程序為：94℃預變性5 min，（94℃變性1 min，Tm退火1 min，72℃延伸1 min）×35個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 SNP基因型檢測

PCR產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳即可分辨，2個純合等位基因型僅一對引物能擴增出單一譜帶，同一樣本兩對特異引物都能擴增出產物為雜合型。

2 結果與分析

2.1 提高SNP特異性的引物設計與篩選

引物3′末端堿基與模板互補則會在適合的條件下發生延伸，否則不能延伸，但是在實際應用中，3′末端單個堿基錯配通常不能阻止擴增延伸。因此，Ye等的研究認為[12]，在特異引物3′端1、2位加入錯配堿基就可以獲得較好的差異產物，并且G/A和C/T錯配為強的堿基錯配類型；C/A和G/T為弱的堿基錯配類型；A/A、C/C、G/G和T/T為中等的堿基錯配類型。也就是說：不同嘌呤、不同嘧啶之間的錯配分別為強錯配，相同嘌呤、相同嘧啶之間的錯配分別為中等錯配，嘌呤和嘧啶之間的錯配為弱錯配。在特異引物3′末端錯配堿基的搭配方面采取強弱搭配，或者中中搭配，獲得理想擴增效果的可能性較大。為了獲得較好的特異性條帶，根據前人研究經驗，本試驗針對母本08576和父本T431分別設計了3對反義鏈引物，這6對引物共用1對正義鏈引物。

引物S401-1、S401-2、S401-3與母本08576的SNP位點互補匹配，其中，S401-1的3′端第二位引入A/G強堿基錯配，S401-2的3′端第三位點引入C/T類型強錯配，S401-3為3′端第二位T/G弱堿基錯配類型和第三位點采用C/T強錯配類型相結合。從PCR效果上看可知，引物S401-3的強弱搭配類型表現出了較好的父母本特異帶型（見圖1）。

圖1 與母本08576的SNP位點匹配的等位基因特異引物的設計與PCR擴增Fig.1 Allele-specific primer designing on the SNP site and PCR results of the parent-08576

引物S401-A、S401-B和S401-C與父本T431的SNP位點互補匹配，其中，S401-A的3'端第二位點引入了A/G強錯配類型，S401-B的3'端第三位點引入了C/T的強錯配類型，S401-C為第二位點T/G弱配和第三位點C/T強配相結合，但是從PCR效果上看，S401-C在父母本間都擴增出了產物，而僅第二位點引入強錯配類型的引物S401-A表現出了良好的特異性（見圖2）。

圖2 與父本T431的突變SNP位點匹配的等位基因特異引物設計及PCR擴增Fig.2 Allele-specific primer designing on the SNP site and PCR rerults of the parent-T431

2.2 AS-PCR反應體系的優化

等位基因特異PCR非常靈敏，其擴增效果與PCR反應體系中每個組分的用量以及PCR程序都密切相關。其中以引物的退火溫度、Mg2+及dNTP濃度的影響較大。在本試驗中，先通過引物合成單以及引物設計軟件Primer Premier 5推薦的退火溫度上下5℃設定梯度，最終確定S401最適溫度為48.2℃，同時也對體系中的Mg2+和dNTP濃度進行梯度篩選，得到最佳的Mg2+和dNTP濃度。

本研究使用濃度為25 mmol·L-1的Mg2+設定了5個梯度分別為1～3 μL，以0.5 μL為間隔梯度。結果表明，引物S401-3在1 μL時在兩親本中都沒有擴增產物，在2～3 μL時兩親本中都擴增出了產物，但是沒有表現出特異性，而1.5 μL時在父母雙親中能擴增出差異的條帶，且無雜帶；引物S401-A在2～3 μL時都沒有表現出引物設計需要的特異性，而在1 μL和1.5 μL時能在親本中表現出與S403-3相反的特異性，其中1.5 μL時條帶更清晰，綜合S403-3的擴增情況，選擇單次取25 mmol·L-1的Mg2+1.5 μL時濃度為最適 Mg2+濃度，即 1.875 mmol·L-1（見圖3、4）。

圖3 等位基因引物S401-3在兩親本間的Mg2+濃度篩選Fig.3 Screening of Mg2+concentration of allele-specific primer S401-3 in both parents

圖4 等位基因引物S401-A在兩親本間的Mg2+濃度篩選Fig.4 Screening of Mg2+concentration of allele-specific primer S401-A in both parents

本研究中dNTP濃度也是設定了5個梯度分別為1～3 μL，以 0.5 μL為間隔梯度。結果發現，引物S401-3在1.5～2.5 μL時不能表現出親本間的差異，而在1～3 μL中都表現出了良好的差異；引物S401-A在1.5～3.0 μL都不能表現出親本間的差異，而1 μL時能表現出與S401-3相反的特異性。從節約成本的角度出發，選定單次取2 mmol·L-1的dNTP 1 μL為最適濃度，即100 μmol·L-1（見圖5、6）。

圖5 等位基因引物S401-3在兩親本間的dNTP濃度篩選Fig.5 Screening of dNTP concentration of allele-specific primer S401-3 in both parents

圖6 等位基因引物S401-A在兩親本間的dNTP濃度篩選Fig.6 Screening of dNTP concentration of allele-specific primer S401-A in both parents

2.3 F2分離群體的SNP分型

利用前面設計的等位基因特異引物及其互補引物，在F2分離群體中進行PCR，以期獲得帶型相反的PCR產物，即可以相互驗證兩對引物的正確性。又可以檢測該位點在材料中是哪種純合基因型還是雜合基因型。S401為A/T突變，在親本T431中T/T純合型，在08576中為A/A純合型，因此在F2群體中，僅在S401-3中獲得擴增目的片段的為A/A純合型，僅在S401-A中獲得擴增目的片段的為T/T純合基因型，同時在S401-3和S401-A中獲得目的片段的為A/T雜合SNP基因型。由圖7可知，F2分離群體中1、4、9、17為純合的父本基因型T/T型，3、7、13為純合的母本基因型A/A型，其余單株為雜合A/T基因型。單株12為不明原因的缺失。圖7中所示Marker條帶從上到下依次為600、500、400。

圖7 互補引物檢測SNP基因型Fig.7 Assaying SNP genotypes with complementary primers

試驗對 438個 F2群體進行 SNP分型，其中能檢測出的317株單株的基因型分型結果如表1所示。另外有121株表現為不明原因的缺失。

表1 F2群體基因型檢測Table 1 Genotype detection of F2group

查X2值表，當自由度為2時，χ20.05,2=5.991，因此χe2=3.4606＜χ20.05,2，實際檢測出的基因分離比與理論分離比1∶2∶1相符合，屬于一對等位基因的遺傳規律。

3 討 論

目前國內番茄抗病育種在基因工程方面應用的技術主要有AFLP、RAPD、微衛星技術等第一代、第二代分子標記[13-15]。而SNP密度高，多態性豐富，具有高度遺傳穩定性，同時SNP是一種二態的標記，非此即彼，在檢測時無需同檢測微衛星標記那樣對片段的長度做出測量，只需一個“+/-”或“全或無”分析的方式，易于分型，有利于快速、自動化篩選和檢測，以及批量、規模篩選和分析[3]。在連鎖群體遺傳作圖方面，具有作為新一代分子標記所特有的價值和意義。

番茄根結線蟲病的研究日益重要[16]，根結線蟲是番茄重要病害之一，在設施番茄栽培中尤為嚴重，國外研究報道相繼指出，番茄根結線蟲抗性是受一個顯性基因支配，定名為Mi基因，到目前為止，Mi基因的抗性仍然是目前唯一被鑒定和利用的根結線蟲抗性，其抗性具有廣譜性，能有效抵抗除北方根結線蟲以外的其他3種主要根結線蟲。本研究中采用的SNP位點是通過對番茄抗根結線蟲Mi基因CDS直接測序發現的。

由于AS-PCR比較靈敏，受PCR體系中dNTP、引物、Mg2+等組分濃度以及退火溫度影響較大，若濃度過低，擴增弱，易出現假陰性，濃度太高，導致擴增非特異性，出現假陽性[10-12]。且不同方法和不同SNP位點對PCR參數要求也不一致，所以本研究通過調整PCR組分濃度或改變PCR程序優化PCR效果，獲得最適濃度和最適退火溫度，解決非特異性擴增。

在等位基因特異引物設計方面，結合了前人的研究成果，首選了第二、三位引入強錯配堿基，以及第二、三中強錯配堿基搭配的方法增加獲得較好差異擴增的可能，節約了成本。從這兩個方面保證了SNP特異擴增的準確性。不同的SNP類型采用同樣的錯配方式設計引物得到PCR效果也不盡相同，這可能與引物末端不同錯配堿基產生的堿基堆積力、氫鍵及其立體結構的穩定性有關。還可能與錯配堿基對和DNA聚合酶之間的相互作用造成的空間位阻有關[17]。為了達到更好的PCR特異性效果，需要對不同的堿基錯配類型的引物都進行PCR反應體系的優化。

SNP分型試驗是為番茄SNP分子標記開發應用提供技術保障；在試驗中，利用了SNP的二態性和便于分型的特點[18]，通過等位基因特異PCR針對S401位點設計的互補的引物對F2群體進行了有效的分型（見圖7），避免了多重PCR反應條件復雜的制約，適用于樣本量適中的分型檢測，其互補引物相互驗證，瓊脂糖電泳即可檢測，分型設計簡單，可靠。F2群體的SNP分型中，其中已得基因型分離比例經卡方測驗符合1∶2∶1的分離比，驗證了試驗的可靠性，但是還有121株表現為不明原因的缺失，一部分可能是由于DNA降解，另一部分可能由于此位點沒有突變，或是其他不明突變所引起等位基因特異PCR產物無條帶。

4 結論

研究表明：引入錯配堿基和優化PCR反應體系可以調節PCR擴增效果。本試驗針對此位點篩選出了特異性最好的與親本08576的匹配引物S401-3，與親本T431的匹配引物S401-A。并針對這兩對等位基因特異引物篩選了最適的PCR反應體系為：總體積 20 μL，模板 DNA 1 μL，10×Buffer 2 μL，10 μmmol·L-1引物各 1.5 μL，2 mmol·L-1dNTP 1 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.5 μL，5 U·μL-1Taq酶0.2 μL。提高了這種分型技術在番茄SNP分型中的準確性。

試驗對438株F2群體進行了SNP分型，其中317株獲得了基因型，121株由于不明原因缺失，這317株中，表現為母本純合基因型的70株，父母本雜合基因型的175株，父本純合基因型的72株，經卡方測驗，符合1∶2∶1分離比例，分型結果可靠，為番茄SNP分子標記開發應用提供技術保障。

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