一種新型結締組織生長因子人源單鏈抗體的可溶性表達以及分離純化

范小波，茍麗霞，劉昭，沈子龍，劉乃豐，吳國球，奚濤

(1.中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇南京 210009;2.東南大學附屬中大醫院臨床檢驗中心，江蘇南京 210009)

結締組織生長因子(CTGF)含有344個氨基酸，由生長因子結合區、整合素蛋白識別功能域、肝素和黏蛋白結合域以及二聚體作用位點4個分泌蛋白模塊組成［1］。在纖維化疾病中，組織生長因子(TGF)作為一個重要的細胞因子能調節胞外基質的形成，研究認為胞外基質表達的調節紊亂和肺纖維化、腎纖維化、肌營養不良以及其他的許多纖維化相關疾病的發病密切相關［1－2］。然而，TGF 是一個具有廣泛生理功能的細胞因子，大量研究顯示直接抑制TGF的生物學功能會抑制正常生理機能，從而對機體造成損害［3］。CTGF作為在纖維化疾病中TGF的一個主要下游分子，有望成為治療纖維化疾病的一個非常理想的靶點。

單鏈抗體scFv由免疫球蛋白的可變區組成，分子量只有正常抗體的1/5［4］，已經被廣泛應用于臨床治療和檢驗。目前，片段抗體的生產大多采用原核表達，但是由于scFv抗體含有兩對二硫鍵，而原核細胞缺少翻譯后修飾，給scFv抗體的生產帶來了一定的技術難題。有文獻報道通過加入融合伴侶谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferas，GST)、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)、麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，MPB)可以幫助蛋白在細胞質中高表達，增加可溶性，而且還具有較高的生物學活性［5－6］。

1 菌株、載體和試劑

1.1 菌株和質粒

大腸桿菌BLR(DE3)菌株和BL21(DE3)菌株購自 New England Biolabs公司(Beverly，MA，USA)，pET28a、pET32a購自 novagen公司(Madison，Wisconsin，USA)，pET-EI:X質粒由普林斯頓大學 David W Wood教授惠贈。

1.2 試劑

內切酶NcoⅠ和NotⅠ購自 New England Biolabs公司;Anti-CTGF scFv基因由東南大學醫學院提供［7］;LB培養基含0.2%葡萄糖、1.5%酵母提取物、2%酪蛋白、2%(NH4)2SO4、0.1%MgSO4、0.3%K2HPO4、1%NaCl，用作BL21的培養液;TB培養基(每升含12 g酪蛋白、24 g酵母提取物、2.31 g KH2PO4和 12.54 g K2HPO4)用于 BLR菌株的培養液;溶菌緩沖液(1 mmol·L－1Tris-HCl、pH 8.5，2 mmol·L－1EDTA，0.1 mg·ml－1lysoozyme)和裂解緩沖液(PBS 緩沖液加上 40 mmol·L－1Bis-Tris、pH 6.2，2 mmol·L－1EDTA)用于pET-EI:X-EI:scFv表達的純化;羊抗鼠HRP-IgG抗體、鼠抗CTGF/CCN2抗體和小牛血清購自R＆D公司(USA);CTGF/CCN2標準品購自Peprotech公司(英國，倫敦);鎳親和柱和Sephadex gel G-50購自Novagen公司(Madison，Wisconsin，USA)。本研究中所使用的其他試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 Scfv抗體表達載體的構建

2.1.1 pET32a-TrxA-scFv-His、pET28a-scFv-His載體的構建 由噬菌體展示技術獲得的scFv基因片段含有NcoⅠ和NotⅠ位點。用NcoⅠ和NotⅠ內切酶分別酶切scFv基因和pET32a、pET28a質粒，用連接酶過夜連接獲得pET32a-TrxA-scFv-His、pET28a-scFv-His表達質粒，并轉入大腸桿菌BL21。所構建的兩個載體都具有ampicillin抗性。

2.1.2 pET-EI:scFv載體的構建 scFv基因先經PCR擴增(引物:5'AAAGTTGTACACAACATGGCCGAG GTGCAGCTGGTGGAGT;3'TGATGGTGATGATGATGT GCGGCCGCACCTA)，在scFv基因5'端添加一個BsrGⅠ內切酶位點。擴增后的scFv基因和pET-Ei:X質粒分別用BsrGⅠ和NotⅠ過夜酶切，然后用連接酶過夜處理，獲得pET-EI:scFv表達載體。pET-EI:scFv表達載體帶有ampicillin和kanamycin抗性。

2.2 scFv在不同載體和菌株中的表達

用pET-EI:scFv質粒轉化BLR，經涂板篩選出具有 ampicillin 抗性的菌株，在37 ℃、170 r·min－1條件下用含有200 μg·ml－1ampicillin的TB 培養基培養過夜，然后在18℃繼續培養24 h，誘導目的蛋白的表達。用pET32a-TrxA-scFv-His和pET28a-scFv-His分別轉化BL21菌株，經涂板ampcillin篩選后，挑選具有ampicllin抗性的克隆分別用BL21培養基在37℃、170 r·min－1條件下培養過夜，用 1.0 mmol·L－1IPTG 誘導目的蛋白表達。各組的裂解產物用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達情況。

2.3 scFv在pET-EI:scFv/BLR中的純化

融合蛋白和scFv的純化步驟參照標準操作手冊［8］。通過搖瓶表達 pET-EI:scFv/BLR，5 000 r·min－1、4℃條件下離心10 min回收細胞。回收的細胞按每克細胞使用5 ml溶菌液重懸，經超聲破碎后于4℃離心回收上清。取10 ml上清轉移到50 ml的離心管中，加入10 ml 3 mol·L－1NaCl;37 ℃孵化10 min，室溫下12 000 r·min－1離心10 min回收沉淀。將沉淀重懸到1 ml預冷的裂解液中，室溫下裂解過夜，然后加入1 ml 3 mol·L－1NaCl溶液，室溫下孵育 10 min 后5 000 r·min－1離心回收上清。

2.4 scFv在 pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中可溶性表達的溫度優化

根據pET使用手冊，本研究對影響蛋白可溶性表達的主要因素溫度進行優化。菌體在37℃下過夜培養后，分別在37 ℃和18 ℃條件下用1.0 mmol·L－1的IPTG誘導表達6 h。離心回收細胞，分別取1 g細胞用溶菌緩沖液裂解，進行SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀中的目的蛋白。

2.5 pET32a-TrxA-scFv-His中 scFv的純化

挑選1個含有 pET32a-TrxA-scFv-His質粒的BL21單克隆在5 ml含0.1%ampicillin的LB培養液中37℃過夜培養，然后轉接到500 ml含0.01%ampicillin的LB培養液中繼續培養，當OD600達到0.6時迅速冷卻至18 ℃，并添加1.0 mmol·L－1的 IPTG 誘導目的蛋白表達5 h。發酵液在室溫條件下，5 000 r·min－1離心10 min回收細胞。回收的細胞按每克細胞使用5 ml溶菌液重懸;重懸液室溫下放置過夜后超聲破碎;4℃下8 000 r·min－1離心20 min回收上清液。上清液用鎳親和層析回收融合蛋白，回收的融合蛋白于純水中過夜透析后凍干處理，凍干樣品按mg蛋白·ml－1酶切裂解液溶解，經凝血酶酶切后用G50層析柱除去雜質，回收scFv蛋白。

2.6 scFv的生物活性測定

將獲得的scFv抗體用2×稀釋的方法從1.6 μg·ml－1到 0.1 μg·ml－1的濃度以 50 μl·孔－1包被到 96 孔板上。4℃過夜后，用含1%tween的PBS洗滌后加入50 μl·孔－1的1.0 μg·ml－1的 CTGF 標準品，于37 ℃ 溫箱中孵育 2 h 后洗滌并加入 50 μl·孔－1的 1.0 μg·ml－1的鼠抗CTGF/CCN2抗體，并在37℃下孵育1 h，再經洗滌后加入 50 μl·孔－1的 1 μg·ml－1羊抗鼠 HRPIgG抗體。最后加入顯色劑，待顯色完全后加入終止液并用ELISA酶標儀記錄結果［9］。

3 結 果

3.1 pET28a-scFv-His、pET32a-TrxA-scFv-His、pET-EI:scFv質粒的構建

3個質粒構建完畢之后送往上海生工(上海)測序，結果顯示3個質粒構建成功。如表1所示，pET28a-scFv-His中，scFv只在N端添加了1個Met密碼子，末尾連接6個HIS密碼子并緊接1個終止密碼子;pET32a-TrxA-scFv-His中，scFv被融合到TRxA蛋白的C端，scFv N端附加6個His;pET-EI:scFv中，scFv被克隆到Intein C端。

表1 抗體蛋白scFv在3種載體中的構建、表達和純化Tab 1 The construction，expression and purification of scFv in three vectors

3.2 scFv在3個質粒和菌株中的表達

如表1所示，scFv蛋白在pET28a-scFv-His/BL21中，誘導前后沒有觀察到目的蛋白明顯表達，Western結果顯示scFv蛋白不表達(data not shown);在pETEI:scFv/BLR和pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中均成功表達(見圖1、2)，其中融合蛋白TrxA-scFv-His相對分子質量約為43 000，Elastin-intein-scFv融合蛋白約為90 000。

圖1 scFv抗體蛋白在pET-EI:scFv/BLR中的表達和純化Fig 1 The expression and purification of scFv in pET-EI:scFv

3.3 scFv在pET-EI:scFv/BLR中的表達純化

通過反復的加入高鹽鹽析和重新溶解，融合蛋白不斷得到純化，但是電泳結果顯示，scFv無法從融合蛋白Elastin-intein-scFv中裂解游離出來(圖1)。

3.4 溫度對scFv蛋白在 pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中表達的影響

pET32a-TrxA-scFv-His/BL21在37℃條件下表達的產物主要為包涵體或者其他不能與鎳柱結合的形式，而18℃條件下scFv的表達主要為可溶性表達，可以吸附到鎳親和柱上，并能被高濃度咪唑溶液洗脫下來(圖3)。

圖2 scFv蛋白在pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中的表達和純化Fig 2 The expression and purification of scFv in pET32a-TrxA-scFv-Hi/BL21

圖3 溫度對scFv蛋白在pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中表達的影響Fig 3 Effect of temperature on the expression of fusion of scFv in pET32a-TrxA-scFv-His/BL21

3.5 scFv蛋白在 pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中的表達和純化

優化后，在18℃條件下表達的scFv主要以可溶性的形式存在，融合蛋白占總蛋白的30%左右，經鎳柱初步純化后回收的融合蛋白的純度能達到50%左右。酶切后經進一步的分子篩分離純化，電泳純度能達到85%以上(圖2)。

3.6 scFv生物學活性測定

如圖4 所示，在包被0、5、10、20、40、80 ng scFv 抗體所測得 OD450nm分別為 0.022 15 ±0.000 85、0.080 35 ±0.002 45、0.162 50 ± 0.005 50、0.321 40 ± 0.015 30、0.631 35 ±0.002 95、1.295 20 ±0.048 80，組內變異系數小于10%。經回歸統計，OD450nm吸收值和抗體含量成線性關系(y=0.016 016x+0.005 071)，R=99.94%，P ＜0.05，說明純化所得抗體 scFv與 CTGF是能特異性結合的，具有良好的生物活性。

圖4 純化后scFv抗體與CTGF特異性結合的酶聯免疫吸附試驗Fig 4 The special affinity of scFv towards CTGF by ELISA

4 討 論

本研究中scFv的基因來源于Griffin.1 library，之前的研究顯示這種來源的基因都很難獲得可溶性表達的產物。我們通過構建pET32a-TrxA-scFv-His質粒在低溫表達的條件下成功獲得溶解性的且具有免疫活性的產物，不同于以往的任何一種已經報道的方法［4］。

大腸桿菌原核表達系統被大規模運用于重組蛋白的表達和生產，具有操作簡單、周期短、耗費低的特點，而且大部分表達的外源蛋白都能保持生物活性。但是，原核系統缺乏真核表達系統所具有的翻譯后修飾功能，很多復雜的具有二硫鍵的外源蛋白會以不具有生物學活性的包涵體形式存在。雖然目前的蛋白復性技術也在不斷發展，但是應用的范圍往往受二硫鍵的多寡和蛋白空間結構的復雜程度的限制，只能應用于一些小的、簡單的、二硫鍵少的蛋白的復性。相對于包涵體表達，可溶性表達具有很多優點，之前很多的研究顯示大量的可溶性表達的蛋白可以不經過復性就具有生物活性。有文獻報道通過加入融合伴侶GST、NusA、MPB可以幫助蛋白在細胞質中高表達，增加可溶性，而且還具有生物活性［5，10－11］。活性蛋白的生成依賴于正確空間結構的形成，二硫鍵的正確形成是含二硫鍵的蛋白能否正確折疊的首要影響因素［12］。大部分分子伴侶無法使scFv在胞內形成二硫鍵，需要在周質空間里進一步的氧化修飾或者體外復性處理。Trx是一種細菌來源的特殊的分子伴侶，它不但能夠促進目的蛋白的折疊，而且能幫助蛋白在細菌體內高效表達、提高穩定性，并形成正確的二硫鍵［13］。

溫度是影響細菌可溶性表達的一個非常重要的因素，在不同的溫度下外源蛋白的表達形式也是不一樣的。有研究報道同一種蛋白在37℃下基本表達成包涵體的形式，但是在30℃下卻主要表達成溶解性的形式，且具有生物活性［14］。低溫能通過降低蛋白合成相關酶的活性減緩蛋白的表達速率，使蛋白有足夠的時間折疊成正確的空間結構［15］。在pET32a-scFv-His/BL21(DE3)表達系統中，溫度是影響蛋白表達形式的主要因素，Trx-scFv-His融合蛋白在37℃下主要以包涵體的形式表達，而在18℃下主要表達成可溶性蛋白。

目的蛋白scFv無法以游離的形式在pET28ascFv-His/BL21(DE3)中表達，可能是mRNA不穩定無法正常轉錄，也可能是蛋白的翻譯過程中出現了某些差錯。在過去的研究中，外源蛋白的不表達一直是一個復雜的至今沒有定論的問題。經過多年的研究發現，分子伴侶的加入不僅可以幫助外源蛋白成功表達，而且還能大大提高表達產率和穩定性。

Intein-system是近年來出現的一種新型表達系統，融合蛋白CBD-intein不但具有純化標簽而且具有自我切割功能［16］。pET-EI:X是最近在Nature上才報道的一種，在Intein-system基礎上改進的集表達純化于一體的新型表達系統。目的蛋白在pET-EI:scFv/BLR(DE3)中也成功得到表達。ELP的功能類似于Trx能幫助scFv的表達，而且由于ELP具有獨特的自我聚集和溶解特性，可以不借助任何傳統的純化方法，只需要通過反復加入高濃度的NaCl就可以達到滿意的純化效果。pET-EI:X的另一個特性就是具有intein，它能通過特定的條件誘導自我裂解將scFv從融合蛋白中釋放出來。然而和現有的其他的具有intein的表達系統一樣，intein的自我裂解并非嚴格意義上可控，和與intein相連的幾個起始氨基酸有著重要關系，甚至外源蛋白的空間結構也能大大影響裂解的效率［17］。scFv蛋白在 pET-EI:scFv/BLR(DE3)中成功得到表達，但是最終無法從融合蛋白上裂解下來，可以通過在外源蛋白的起始區加入一段連接肽，比如在這個系統中已經表達成功的GFP的一段起始蛋白序列來幫助目的蛋白從融合蛋白上成功裂解。

體外酶聯免疫吸附實驗顯示，通過pET32a-scFv-His/BL21(DE3)低溫表達后純化獲得的目的蛋白與CTGF/CCN2的結合具有良好的特異性。接下來的工作，我們將進一步觀察這個抗體蛋白在動物小鼠模型體內的抗纖維化活性，這將是目前已有研究中首次報道用CTGF的scFv抗體治療纖維化疾病。因為此scFv抗體來源于人類自身抗體庫，在人體中不會引發抗原抗體反應，如果活性良好，將有望成為首個能應用于臨床的治療肺纖維化的抗體藥物。

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