肺癌患者調節性T細胞的變化及CpG ODN的干預作用

何曉燁 蔡映云 (上海復旦大學附屬中山醫院老年病科,上海 200032)

肺癌是發病率較高的一種難治性惡性腫瘤,免疫系統的功能失衡會導致其發生、發展。同時,肺癌免疫治療療效的不盡人意也提示著可能存在某些免疫逃逸因素。CD4+CD25+調節性T細胞是一類具有免疫調節功能的T細胞亞群。既往的研究顯示,CD4+CD25+調節性T細胞參與了機體調節免疫耐受,并與腫瘤免疫逃逸過程有著密切的關系[1,2]。CpG ODN(cytosine-phosphorothioate-guanine oligodeoxyn ucleotides)是一類含有胞嘧啶-鳥嘌呤結構的細菌DNA、質粒DNA和寡核苷酸(ODN)的物質。有文獻指出,CpG ODN能通過直接下調調節性T細胞來有效增強自身抗腫瘤的免疫能力[3]。

本研究比較了初診、初治的肺癌患者與健康志愿者的調節性T細胞比例、Foxp3基因表達、TGF-β和IFN-γ水平,并對肺癌患者的外周血單個核細胞進行CpG ODN 2006(實驗組)或CpG ODN 1612(安慰劑組)干預,比較兩組在干預前后的調節性T細胞比例、Foxp3基因表達、TGF-β及IFN-γ水平的變化。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集30例于2008年5月～9月間入住復旦大學附屬中山醫院胸外科的初診肺癌患者,均為未經化療及其他生物治療的初治患者,不伴有自身免疫性疾病,均經病理組織學證實為非小細胞肺癌。其中男性18例,女性 12例,平均年齡(60.07±13.1)歲(41～86歲)。組織學類型:腺癌23例、鱗癌6例、混合性癌1例。根據2003年國際抗癌聯盟(UICC)的分期標準:Ⅰ期10例、Ⅱ期6例、Ⅲ期11例、Ⅳ期3例。對照組為30例健康志愿者。所有入選者均獲得知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 OD260/280核酸定量分析儀(Pharmacia公司);PCR儀(PE公司);凝膠成像系統(Alpha Innotech公司);FACS Calibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司);淋巴細胞分離液(國藥集團化學試劑有限公司);PCR引物、CpG ODN 2006及CpG ODN 1612委托上海生工生物技術有限公司合成,Foxp3上游引物:5'-ACAGCACATTCCCAGAGTTCCT-3',下游引物:5'-TCTCCACCCGCACAAAGCA-3';CpG ODN 2006:5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3';CpG ODN 1612:5'-GCTAGAGCTTAGGCT-3';Trizol(Invitrogen公司);逆轉錄試劑盒(Fermentas公司);50 bp DNA ladder(北京天根生物技術公司);2×Pfu PCRmaster mix(北京天根生物技術公司);FITC-CD4和PE-CD25抗體(Invitrogen公司);TGF-β及IFN-γ的ELISA試劑盒(上海元象醫療器械有限公司)。

1.3 標本處理 采集肺癌患者和健康志愿者空腹狀態下的外周靜脈血,分為2份。一份離心后取血清置-20℃冰箱保存,待測TGF-β及 IFN-γ。另一份用肝素抗凝,以淋巴細胞分離液常規分離外周血單個核細胞(PBMC),計數細胞后調整細胞濃度至1～2×106ml-1,以流式細胞儀檢測CD4+CD25+調節性T細胞。

將肺癌患者的PBMC隨機分為實驗組和安慰劑組,每組各15例。實驗組給予1μ mol/L的CpG ODN 2006,安慰劑組給予 1 μ mol/L 的 CpG ODN 1612,在37℃、5%CO2的培養箱中培養48小時后收集細胞,以流式細胞儀檢測CD4+CD25+調節性T細胞,并取上清液檢測TGF-β及IFN-γ。

1.4 流式細胞儀檢測 取100 μ l PBMC或經培養后收集的細胞,加入 1 μ l FITC標記的鼠抗人CD4,PE標記的CD25抗體,避光孵育30分鐘后加入PBS洗滌2次,2 000 r/min離心5分鐘后棄上清,加入500 μ l PBS,FACS Calibur流式細胞儀檢測。

1.5 RNA抽提及Real-time PCR 將患者和對照組的PBMC標本用RNA抽提試劑盒提取總RNA,操作步驟按說明書進行。以此RNA為模板,加入引物oligo(dT)18及Rnase-free水,65℃加熱5分鐘,迅速在冰上冷卻。再加入逆轉錄緩沖液、dNTPs、逆轉錄酶和RNA酶抑制劑,繼續反應42℃50分鐘,99℃1分鐘。cDNA分別以GAPDH和Foxp3為引物,進行PCR反應。反應條件為:95℃5分鐘,94℃30秒,60℃30秒,72℃30秒,72℃10分鐘,共 40個循環。反應產物經2%瓊脂糖凝膠電泳,Foxp3擴增片段192 bp,GAPDH擴增片段450 bp,凝膠成像系統成像拍照,灰度掃描分析結果。將目的條帶的灰度值與內參的灰度進行比對得到目的基因的相對表達值。

1.6 TGF-β及IFN-γ檢測 取肺癌患者和健康志愿者血清以及肺癌患者PBMC在CpG ODN干預前后的上清液檢測TGF-β及IFN-γ,采用 ELISA法,按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 肺癌患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞比例的變化情況 肺癌患者外周血中CD4+CD25+T占總CD4+T細胞比例明顯高于健康對照組(42.14%±14.32%vs 8.42%±2.69%,P＜0.05,圖 1)。在肺癌患者中不同病理類型亞組的CD4+CD25+T占CD4+T細胞比例分別為腺癌43.96%±12.26%、鱗癌32.89%±19.3%、混合性癌55.8%,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1);在不同分期亞組中分別為Ⅰ期46.88%±13.22%、Ⅱ期38.74%±22.11%、Ⅲ期37.77%±10.87%、Ⅳ期49.17%±6.73%,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1)。

圖1 肺癌患者與健康志愿者外周血CD4+CD25+T細胞比例比較Fig.1 Proportion of CD4+CD25+T in PBMC of lung cancer patients and healthy volunteers

2.2 肺癌患者外周血Foxp3基因的表達 RT-PCR檢測結果顯示,肺癌患者外周血的Foxp3基因的相對表達量要明顯高于健康對照組(0.96±0.44 vs 0.66±0.09,P ＜0.05,圖2)。

圖2 CpG ODN干預前后Foxp3基因的表達Fig.2 Foxp3 gene expression before and after CpG ODN treatment

2.3 肺癌患者血清TGF-β及IFN-γ檢測結果 肺癌患者血清TGF-β值明顯高于健康對照組,差異具有顯著性[(67.24±8.79)vs(33.58±4.74)pg/ml,P＜0.05,表1]。不同病理類型患者亞組的TGF-β值分別為腺癌(68.10±9.51)pg/ml、鱗癌(64.95±5.83)pg/ml、混合性癌61.32 pg/ml,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1)。不同分期患者亞組的TGF-β值分別為Ⅰ期(70.53±10.08)pg/ml、Ⅱ期(68.22±6.22)pg/ml、Ⅲ期(62.32±4.78)pg/ml、Ⅳ期(72.34±14.96)pg/ml,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1)。肺癌患者血清IFN-γ值略低于健康對照組,但差異不具有顯著性[(30.40±9.52)vs(33.33±20.02)pg/ml,P＞0.05,表1)]。不同病理類型患者亞組的IFN-γ值分別為腺癌(31.06±10.82)pg/ml、鱗癌(28.34±1.38)pg/ml、混合性癌55.8 pg/ml,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1)。不同分期患者亞組的IFN-γ值分別為Ⅰ期(33.67±16.46)pg/ml、Ⅱ期(28.84±1.30)pg/ml、Ⅲ期(28.71±1.21)pg/ml、Ⅳ期(28.82±1.6)pg/ml,差異不具有顯著性(P＞0.05,表 1)。

2.4 CpG ODN干預后肺癌患者CD4+CD25+調節性T細胞比例、Foxp3基因表達、TGF-β及 IFN-γ變化 CpG ODN干預后,CpG ODN 2006干預組患者的CD4+CD25+T細胞比例降低[(44.16±11.61)vs(36.52±10.78)%,P＜0.05,表 2]、Foxp3基因表達減弱(1.15±0.48 vs 0.65±0.17,P ＜0.05,圖 2)、TGF-β水平降低[(68.25±9.25)vs(58.22±4.16)pg/ml,P＜0.05,表2)],IFN-γ水平的變化在干預前后無顯著的統計學差異(35.26±14.24 vs 28.99±1.03,P＞0.05,表2)。CpG ODN 1612安慰劑組患者的CD4+CD25+T細胞比例、Foxp3基因表達、TGF-β及 IFN-γ水平在干預前后的變化無顯著的統計學意義(表2)。

表1 肺癌患者 CD4+CD25+T細胞比例、TGF-β及IFN-γ檢測結果Tab.1 Proportion of CD4+CD25+T,TGF-β and IFN-γin lung cancer patients

表2 肺癌患者外周血在 CpG ODN干預前后CD4+CD25+T細胞、Foxp3基因表達、TGF-β及IFN-γ變化情況Tab.2 The change of CD4+CD25+T,Foxp3 gene expression,TGF-β and IFN-γbefore and after CpG ODN treatment in PBMC of lung cancer patients

3 討論

CD4+CD25+調節性T細胞是具有特定表型和抑制功能的T淋巴細胞亞群,可通過多種方式抑制抗腫瘤免疫反應從啟動到效應的整個階段,在腫瘤免疫逃逸中起著重要作用。Foxp3是CD4+CD25+調節性T細胞的一個特征性標志,是其獲得免疫調節特性的關鍵轉錄因子。近年的研究發現,腫瘤患者體內CD4+CD25+調節性T細胞數量增高是抑制腫瘤免疫的機制之一,它們通過與細胞直接接觸或分泌抑制性細胞因子,如TGF-β的方式發揮免疫抑制作用[4,5]。我們的研究發現,肺癌患者外周血中的CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例及TGF-β水平均明顯高于健康對照組,提示了肺癌患者的免疫系統處于抑制狀態,但不同病理分型及不同分期的肺癌患者亞組間的比較無顯著差異。

含CpG序列(非甲基化胞嘧啶-鳥嘧啶二核苷酸為核心的特定核苷酸序列)的寡脫氧核苷酸(CpG ODN)不僅可通過啟動機體病原相關分子模式(pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs)誘導分泌多種細胞因子,如IFN-γ等來激活機體免疫系統,還可調節免疫應答向Th1型轉化、減少T細胞凋亡,從而起到抗腫瘤的作用[6,7]。如將序列中的CpG甲基化或將CpG替換成其他序列,如CpC、GpC等均將喪失或降低其免疫刺激作用。本研究中,我們分別以硫代化修飾、具有活性作用的CpG ODN 2006作為陽性干預劑和不具有活性的CpG ODN 1612作為安慰劑干預肺癌患者的外周血單個核細胞,結果發現CpG ODN 2006治療組的CD4+CD25+T細胞比例、Foxp3基因表達及TGF-β水平在干預后均較干預前有所下降,而安慰劑組的上述指標則在干預前后無顯著差別。IFN-γ水平在干預前后的變化在兩組中均無顯著性差異。提示了CpG ODN具有下調CD4+CD25+Foxp3+的調節性T細胞比例、減少TGF-β分泌的作用,但刺激IFN-γ的作用并不明顯。

1 Field EH,Matesic D,Rigby S et al.CD4+CD25+regulatory cells in acquired MHC tolerance[J].Immunol Rev,2001;182:99-112.

2 Somasundaram R,Jacob L,Swoboda R et al.Inhibition of cytolytic T lymphocyte proliferation by autologous CD4+/CD25+regulatory T cells in a colorectal carcinoma patient is mediated by transforming growth factor beta[J].Cancer Res,2002;62(18):5267-5272.

3 Smyth M J,Teng M W,Swann J et al.CD4+CD25+T regulatory cells suppressNK cell-mediated immunotherapy of cancer[J].J Immunol,2006;176(3):1582-1587.

4 Vollmer J.CpG motifs to modulate innate and adaptive immune responses[J].Int Rev Immunol,2006;25(3-4):125-134.

5 Wang R F.Regulatory T cells and toll-like receptors in cancer therapy[J].Cancer Res,2006;66(10):4987-4990.

6 Seo N,Hayakawa S,Takigawa M et al.Interleukin-10 express at early tumor sites induces subsequent generation of CD4+T regulatory cells and systemic collapse of antitumour immunity[J].Immunology,2001;103(4):449-457.

7 Chen Z M,O'Shaughnessy M J,Gramaglia I et al.IL-10 andTGF-beta induce alloreactive CD4+CD25-T cells to acquire regulatory cell function[J].Blood,2003;101(12):5076-5083.