西南地區鴨疫里默氏菌血清型調查和三價滅活油乳劑疫苗的研制

田 令 ，岳 華 ，2，湯 承 ，2

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.四川省高等院校動物醫學重點實驗室，四川 成都 610041）

1 材料

1.1 菌株 2006年1月至2009年7月，從四川、重慶、云南規模化養鴨場中分離得到的261株鴨疫里默氏菌（RA），均為本室保存。

1.2 實驗動物 1日齡健康櫻桃谷鴨,購自成都某種禽公司；昆明系雄性小白鼠18～22g，購自川北醫學院實驗動物中心。

1.3 培養基和血清 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）購自杭州微生物試劑有限公司；LB培養基為本實驗室配制；新生小牛血清購自成都哈里生物公司；血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型RA參考菌株由中國動物衛生與流行病學中心李明義教授惠贈。10號白油購自廣州俏靈兒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 血清型鑒定 采用玻片凝集試驗對261株RA分離菌株進行血清型鑒定。

2.2 RA菌液濃度的測定 將RA接種于含5%小牛血清的LB肉湯中，置于37℃下振蕩培養18h，用菌落平板計數法測定10倍系列稀釋菌液的CFU，同時用紫外分光計測定對應濃度菌液的OD值，建立標準曲線。

2.3 疫苗株的篩選 挑選血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA分離菌株各5株，分別制備不同血清型的RA單價滅活油乳劑疫苗，疫苗中的抗原濃度為1.0×109CFU/mL。按下列程序免疫小鼠，每種疫苗免疫5只小鼠：首免，頸部和背部四點注射，每只0.2mL；分別間隔15d和10d后用相同劑量和方法進行二免和三免；三免后第9 d對各組小鼠斷尾采血，分離血清，用玻片凝集試驗檢測血清RA凝集價，選擇各血清型中凝集價最高的RA菌株為疫苗種子株。

2.4 RA三價滅活油乳劑疫苗的制備 分別將3個血清型RA種子株接種于含5%血清的LB肉湯中，37℃振蕩培養18h，加入0.3%甲醛溶液后置于37℃振蕩培養箱里滅活18h，按文獻方法制備RA三價滅活油乳劑疫苗，疫苗中各型抗原含量均為1.6×109CFU/mL，同時進行質量檢驗。

2.5 安全性試驗 將33只3日齡健康雛鴨隨機平均分成3組，每組11只。第1組注射RA三價滅活油乳劑疫苗1mL，第2組注射三價滅活油乳劑疫苗2mL，第3組注射1mL無抗原佐劑乳化物作為免疫空白對照。

2.6 免疫效力測定 將288只3日齡健康雛鴨平均分成2組，每組 144只。第1組為免疫組，經頸部皮下接種0.5mL/只RA三價滅活油乳劑疫苗；第2組為空白對照組，經頸部皮下接種相同劑量的無抗原佐劑乳化物。各組于免疫后第6 d、14 d、21 d、28 d分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA攻毒。每組每個血清型分別攻毒12只，2×108CFU/只，連續觀察7d，記錄發病死亡情況。對死亡鴨進行剖檢和細菌分離，存活鴨于觀察結束時處死，同樣進行病例剖檢和細菌分離，以未出現病變和RA分離陰性為免疫保護。

3 結果

3.1 RA分離株的血清型 對261株RA血清型的鑒定結果顯示，血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型RA分別占總分離株的39.85%、17.24%、11.11%、8.8%，未檢出血清Ⅲ型菌株，未定型菌株占23.2%。

3.2 疫苗種子株的篩選結果 根據免疫后小鼠血清平板凝集價分別篩選出血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 型RA疫苗的種子株各1株，菌株編號為SWUN0269、SWUN1065、SWUN1093。

3.3 疫苗質檢結果 RA三價滅活油乳劑疫苗離心15min無分層現象，滴于冷水表面不分散，為油包水狀態，黏度試驗顯示流速為6.4s，菌檢結果為陰性。

3.4 疫苗的安全性 2mL/只注射組的雛鴨僅在12h內精神稍差，食欲有所下降，之后恢復正常；1mL/只注射組和1mL/只空白對照組的鴨只未見異常。

3.5 疫苗免疫效力 三價滅活油乳劑疫苗首免后各組鴨只的攻毒保護情況見表1。

表1 RA三價滅活油乳劑疫苗免疫后不同時間的攻毒保護結果

從表1可見，免疫后6 d攻毒，免疫組和空白對照組之間保護數無顯著差異，說明此時疫苗尚未產生有效免疫保護；至免疫后第14 d，免疫組的攻毒保護率顯著高于空白對照組，對3個血清型的攻毒保護率均在83.33%～100%，并持續至28 d未見下降。

4 討論

本研究結果顯示西南地區至少存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ4個不同的血清型，說明西南地區鴨群中鴨疫里默氏菌病的病原復雜多樣，血清Ⅰ、Ⅱ型為優勢血清型，與國內其他地區情況類似。值得注意的是，2003年四川、重慶、云南等省市的血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA菌株占總分離株的52.06%，而我們的研究結果顯示2006～2009年這些地區Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型分離株占總分離株的68.20%，分離率有顯著增高的趨勢，這也是本研究選擇研究三價滅活疫苗的重要依據。

此次我們的研究結果顯示，在3日齡免疫后14d分別用同型RA攻毒，其保護力均達到83.33%以上，有的血清型的保護率高達91.67%，與文獻比較有的血清型攻毒保護力稍低，這可能與攻毒濃度及不同血清型RA毒力差異和對雛鴨免疫的日齡有關。從后兩次攻毒保護試驗來看，最高保護力也可達到100%，且持續至28d保護力未下降，說明該三價滅活油乳劑疫苗在對雛鴨進行一次免疫后就具有很好的保護力，且持續期長，足以保護雛鴨至上市日齡。

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