AFLP標記檢測大足黑山羊地方類群遺傳多樣性的研究

楊國鋒 ，孫 娟 ，張家驊

（1.西南大學動物科學技術學院，重慶 400716；2.青島農業大學生命科學學院，山東 青島 266109；3.青島農業大學動物科學技術學院，山東 青島 266109）

AFLP是1993年由荷蘭科學家Zabeau和Vos建立的一種檢測DNA多態性的方法，結合了RFLP和RAPD的優點，既具有RFLP標記的專一性、可靠性，又具有RAPD標記的隨機性、方便性。該技術自1995年報道以來，以較好的穩定性和較高的多態檢出率而受到分子生物學家的關注，并得到了廣泛應用。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 血樣采自重慶市大足縣某羊場。

1.2 試劑 TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4DNA連接酶、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、尿素、親和硅烷、剝離硅烷、引物為北京鼎國產品；TaqⅠ、EcoRⅠ酶為Promega公司產品。接頭、引物序列見表1。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 采用常規的苯酚-氯仿法。

1.3.2 接頭的準備 EcoRⅠ和TaqⅠ接頭濃度分別為5pM和50pM。

1.3.3 基因組DNA的酶切和接頭的連接 酶切：DNA 0.5μg、EcoRⅠ5 U、TaqⅠ5 U、5×R/L buffer 3μL，加ddH2O 至 15μL；離心，37℃孵化 2～3 h，70℃孵化15min，使內切酶失活。連接：加入混合液（EcoRⅠ接頭 1 μL、TaqⅠ接頭 1μL、5×R/L buffer 2μL、T4 DNA ligase 2 U、ATP 1mM，加 ddH2O 至 10μL），37℃孵化8 h或過夜。0.8%瓊脂糖凝膠檢測，用TE0.1溶液將產物按1∶10比例稀釋，-20℃保存。

表1 AFLP接頭、預擴增、擴增引物序列

1.3.4 限制性片段預擴增 引物為50ng/μL，預擴增體系：EcoRⅠ+A、TaqⅠ+A/C 各 1.5μL、dNTPs 0.2mM、Taq 酶 1.5U、10×PCR buffer（含 Mg2+）5 μL、稀釋產物5μL，用ddH2O補足50μL。PCR擴增條件：94℃ 2min；94℃ 60 s，56℃ 60 s，72℃ 60 s，共 26 個循環；72℃5min，4℃保存。0.8%瓊脂糖凝膠檢測，用TE0.1將產物按1∶10比例稀釋，-20℃保存。

1.3.5 限制性片段選擇性擴增 擴增體系：EcoRⅠ、TaqⅠ引物各1.5μL，其余同上（限制性片段預擴增），PCR 擴增條件：94℃ 2min；94℃ 30s，65℃ 30 s，72℃60 s（以后每個循環的退火溫度降0.7℃），共13個循環，接著94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，共23個循環；72℃ 2min，4℃保存。擴增后，取5μL選擇性擴增產物，加5μL上樣緩沖液，95℃變性3min，冰浴冷卻，備用。

1.3.6 電泳 瓊脂糖凝膠電泳后，采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染，掃描成像。

2 結果與分析

2.1 瓊脂糖電泳檢測結果 DNA條帶致密整齊，無拖尾，所得基因組無降解；總DNA分子量大小在50kb以上；所測樣品OD260/OD280在1.8左右，說明蛋白質和DNA提取過程中的其他殘留較少。酶切基因組DNA的主帶消失，呈梯度模糊狀，說明酶切充分，達到實驗要求。預擴增和選擇性擴增產物，無拖帶，擴增產物效果良好。

2.2 變性聚丙烯酰胺檢測結果 從15對引物中篩選，有11對引物擴增效果較好，擴增出了766個條帶，平均每對引物擴增出69.6個條帶，其中發現59條多態條帶，平均多態率為5.36%，結果見表2。

3 分析討論

3.1 關于實驗條件

表2 11對引物組合的遺傳多樣性

3.1.1 高質量DNA樣品的準備 高質量DNA樣品至少具備以下特性：分子量高，在DNA的提取過程中，為防止DNA斷裂，振蕩一定要柔和；純度高，不能含抑制限制性內切酶活性的物質，否則將使隨后的DNA酶切不完全，應注意避免核酸酶、其他DNA污染和抑制物質的存在。

3.1.2 限制性核酸內切酶的選擇 常采用兩種限制性內切酶，一種酶的識別位點為4個堿基，可以產生小片段DNA便于擴增，另一種為6個堿基，可控制擴增片段的數量。EcoRⅠ可靠、高效而價廉，是六堿基內切酶的首選酶類；而四堿基內切酶在分析植物和微生物基因組時大多選用MseⅠ，分析動物基因組時常用TaqⅠ。Msp和Hinp識別序列（CCGC，GCGC）含有GC雙堿基序列，因此也可以替代TaqⅠ使用。

3.1.3 關于銀染 銀染過程中，水質很重要，應保證水的純凈和容器的潔凈。季節對銀染效果也有影響，銀染效果以夏秋季節較好，冬季染色效果不良。加甲醛使Ag2+還原成銀顆粒，應待硝酸銀充分溶解并搖勻后，再將玻璃板放入，否則會造成背景雜亂。顯影時間過短，則顯影不充分，譜帶模糊；過長，膠板上部大分子量片段被背景遮蓋，影響結果統計，要在主要帶紋出現后立即定影，一般5～8min左右即可充分顯影。顯影液溫度可適當低一些，這樣可降低背景顏色，但不可過低，否則會使顯色時間延長，影響實驗效果。

3.2 關于多態性 平均多態率僅5.36%，較低，原因有：個體間親緣關系近，堿基差異小；擴增條帶多集中于凝膠上部，其分子量較大，堿基的差異不易檢測。顯色往往是自上而下，上下顯影相差1～2min，時間不同步就會造成小片段不能完全顯色。因此，多態條帶集中在一定區域，本實驗差異片段主要集中在150bp～600bp之間。

[1]Pieter V，Rene H，et al.AFLP：a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Res.，1995，21：4407-4414.

[2]朱文進，曹瑞琴，張紀剛，等.分子標記AFLP及其在遺傳分析中的應用 [J].動物科學與動物醫學，2001，19（5）：21-23.