三葉肽TFF1在大腸癌中的表達

周 斌,吳 斌,徐 亮,黃小紅

(1.揚州大學附屬泰興市人民醫院胃腸外科,江蘇揚州225400;2.瀘州醫學院附屬醫院普外科,四川瀘州646000)

三葉肽TFF1(trefoilfactor family 1)是三葉因子家族成員之一,該家族包含3個成員:乳腺癌相關肽(pS2/TFF1)、解痙攣多肽(SP/TFF2)和小腸三葉肽(ITF/TFF3)。三葉肽具有保護胃腸黏膜、促進損傷組織愈合及腫瘤抑制等作用。Wu等[1]研究發現,給予燒傷后實驗鼠hTFF1融合蛋白灌胃,能明顯改善實驗鼠胃黏膜損傷。有研究發現,在上皮重建的體外模型上,即在連續的細胞單層上人為造成刮傷,當加入三葉肽后,上皮細胞向損傷部位的移動速率比對照組增加3～6倍。Karam等[2]研究TFF1缺乏鼠證實,TFF1為胃癌抑制基因,TFF1敲擊鼠的胃幽門竇黏膜凹陷細胞的祖細胞與胃癌生成有關。在正常情況下,TFF1在胃小凹上皮細胞(主要在胃底和胃竇黏液細胞)表達,在大腸黏膜組織中不表達,因此本研究TFF1在大腸正常組織及大腸腺瘤、腺瘤惡變、大腸癌組織中的表達,分析其與臨床病理特征的關系,探討TFF1在大腸癌發生中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 搜集瀘州醫學院附屬醫院普外科2004年1～12月住院患者中大腸腺瘤27例,大腸腺瘤惡變22例,大腸癌40例,并取因外傷而行部分結腸切除患者正常大腸組織20例。其中男62例,女47例;年齡35～87歲,平均 57.75歲。將手術切除標本(約2.0 cm×1.5 cm×0.3 cm大小)制成石蠟標本,4℃冰箱保存。以上標本均經病理檢查證實。

1.2 試劑 TFF1單克隆抗體(購于北京中山生物技術有限公司)和免疫組化染色試劑盒(SP-9002,購于北京中山生物技術有限公司)。

1.3 檢測方法 采用鏈親合素生物素免疫過氧化物酶法(streptavidin-biotin immunoperoxidase method,S-P)檢測所取組織中TFF1的表達。操作步驟:(1)石蠟切片,常規脫蠟至水。(2)3%H2O2去離子水孵育5～10 min,以消除內源性過氧化物酶活性,蒸餾水沖洗,PBS浸泡5 min。(3)熱抗原修復,電爐加熱至沸騰后斷電,自然冷卻。(4)滴加封閉用正常山羊血清工作液,室溫孵育10～15 min,傾去,勿洗,滴加適當比例稀釋的一抗,37℃孵育2～3 h或4℃過夜。(5)PBS沖洗3次,每次3 min。滴加生物素化二抗工作液,室溫或37℃孵育10～15 min。PBS沖洗3次,每次3 min。(6)滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,室溫或37℃孵育10～15 min。(7)PBS沖洗3次,每欠 3 min。顯色劑顯色(DAB)。(8)自來水沖洗。蘇木精復染,脫水,透明。樹脂封片,顯微鏡下觀察。

1.4 統計學處理 全部數據均用SPSS10.0統計軟件處理。計數資料兩組之間比較用非參數檢驗中Ridit分析,相關性分析以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TFF1表達 以大腸腺體細胞處出現棕黃色顆粒為TFF1表達陽性,根據細胞染色強度將切片分為陰性(-)、陽性(+)、中度陽性(++)、強陽性(+++)。其判斷標準為:每張切片隨機選取3個高倍視野(×400),(-):高倍視野中無陽性細胞;(+):高倍視野中陽性細胞數小于25%;(++):高倍視野中陽性細胞數為25%～50%;(+++):高倍視野中陽性細胞數大于50%。其中同一切片中(++)和(+++)表達細胞之和大于30%為明顯表達。正常大腸組織及大腸腺瘤、腺瘤惡變、大腸癌組織中 TFF1表達情況見表1。

表1 TFF1表達情況

2.2 TFF1與大腸癌臨床、病理指標的關系

2.2.1 TFF1表達與Dukes分期的關系 40例大腸癌患者中,Dukes A期7例,B期12例,C期13例,D期8例,見表2。

表2 TFF1因子表達情況與Dukes分期的關系

2.2.2 TFF1表達與腫瘤分化程度的關系 40例大腸癌患者中,高分化10例,中分化14例,低分化16例,見表3。

表3 TFF1因子表達情況與腫瘤分化程度的關系

2.2.3 TFF1表達與淋巴結轉移的關系 40例大腸癌患者中,有淋巴結轉移23例,無淋巴結轉移17例,見表4。

表4 TFF1因子表達情況與淋巴結轉移的關系

3 討 論

三葉肽TFF1是三葉因子家族成員之一,是胃腸道激素的一種,在胃腸道黏膜損傷修復過程中發揮重要作用。在正常情況下,TFF1在胃小凹上皮細胞(主要在胃底和胃竇黏液細胞)表達,在大腸黏膜組織中不表達。本研究結果也表明,在正常大腸組織中,無1例TFF1表達,大腸腺瘤、大腸腺瘤惡變時,TFF1表達,與大腸正常組織比較差異有統計學意義(P＜0.05)。大腸癌時,TFF1表達明顯,與正常大腸組織、大腸腺瘤、腺瘤惡變比較差異均有統計學意義(P＜0.05),且其總表達的百分率和明顯表達的百分率居最高。提示TFF1的表達與大腸病變、腫瘤發生有關。Mochizuka等[3]研究表明,TFF1在大腸腺瘤、大腸增生性息肉中表達上調。

TFF1的這種表達特性,在大腸癌的發生、發展中其作用機制可能有以下3個方面:(1)三葉肽TFF與黏液糖蛋白MUC相互作用形成黏液膠樣層,從而保護消化道黏膜避免有害因子的損傷。但三葉肽和黏液糖蛋白分布均有組織特異性,在正常大腸黏膜組織中,MUC2、MUC3陽性表達,二者與TFF3相互作用形成黏液膠樣層,而 TFF1正常應在胃黏膜組織中表達,與MUC1、MUC5AC、MUC6形成黏液膠樣層[4],因此異位分布的TFF1與大腸黏膜組織的M UC2、MUC3相互作用減弱,不能保護大腸黏膜避免有害因子的入侵。(2)既往研究表明TFF1在胃癌中表達缺失,被視為胃癌的抑癌基因[2],與大腸癌不同,提示TFF1在不同腫瘤發生機制中的復雜效應。Bossenmeyer-Pourié等[5]發現 TFF1在胃腸道細胞中有抗增殖和抗凋亡雙重特性。三葉肽的黏膜修復涉及到 ras依賴性有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和上皮生長因子受體(EGFR)的激活,這些途徑與E-鈣黏附因子由細胞表面向細胞內重新分布和蛋白激酶B(PKB)的磷酸化有關,而這種酶與抗凋亡有關;三葉肽還能阻斷與EGFR和p13激酶有關的p53依賴或非依賴途徑的凋亡[6]。因此長期慢性炎癥導致機體內環境紊亂,TFF1表達增強,不易凋亡的損傷組織細胞逐漸惡變,可能向大腸腫瘤發展。(3)有研究指出,TFF1在消化道、泌尿系統炎癥性疾病和腫瘤中高表達,猜想TFF1和Cdc25A-B協同其他優勢致瘤途徑誘導腺瘤和腺瘤惡變,以TFF1、Cdc25信號通路為靶目標治療TFF1陽性實體腫瘤患者是有益的[7]。Abdou等[8]研究證實,TFF1在前列腺癌中高表達,Amiry等[9]研究發現,TFF1在乳腺癌細胞中高表達,抗TFF1的表達可作為乳腺癌治療的一種新的治療策略。

本研究還發現,TFF1在Dukes B、A期和高、中分化大腸癌時表達明顯,且TFF1表達與淋巴結轉移不相關。TFF1在正常大腸黏膜組織中不表達,在大腸腺瘤、腺瘤惡變時開始表達,大腸癌時表達明顯。但本研究發現,在腫瘤晚期、惡性程度最高、明顯淋巴結轉移時TFF1反而表達不明顯。究其原因,可能與大腸癌晚期時大腸正常黏膜破壞嚴重、致黏膜分泌TFF1的細胞功能喪失有關。周林靜等[10]研究后得出相似結論。Tuna等[11]指出,TFF1在直腸腺癌發展中參與了腫瘤入侵,與術后復發可能有關。

總之,三葉肽 TFF1在大腸正常黏膜組織中無表達,大腸腺瘤時開始表達,大腸癌時表達明顯,提示TFF1在大腸癌的發生、發展中可能起著一定的作用,其可能機制有待進一步研究。

[1]Wu W,Wang L,Sun Y,et al.Influence of human trefoil factor 1(hTFF1)fusion protein on gastric mucosal lesion in mice after burn injury[J].Zhonghua Shao Shang Za Zhi,2008,24(6):421.

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[5]Bossenmeyer-Pourié C,Kannan R,Ribieras S,et al.The trefoil factor 1 participates in gastrointestinal cell differentiation by delaying G1-S phase transition and reducing apoptosis[J].J Cell Biol,2002,157(5):761.

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[8]Abdou AG,Aiad HA,Sultan SM.pS2(TFF1)expression in prostate carcinoma:correlation with steroid receptor status[J].APMIS,2008,116(11):961.

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[10]周林靜,趙長宏,魯海玲,等.TFF1和 HSP70在結腸癌中的表達及臨床意義[J].實用腫瘤學雜志,2007,21(2):111.

[11]Tuna B,S?kmen S,Sarioglu S,et al.SPS2 and HSP70 expression in rectal adenocarcinomas:an immunohistochemical investigation of 45 cases[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2006,14(1):31.