59份人腦膠質瘤組織體外培養的藥敏分析*

卞 偉,戴勤弼,童建國,阮 健

(重慶市腫瘤研究所神經外科 400030)

腦膠質瘤是最常見的顱內腫瘤,因其呈浸潤性生長,治療困難。目前對腦膠質瘤的臨床治療策略仍是在手術切除腫瘤主體的基礎上,繼續采用多種手段殺滅殘存瘤細胞或抑制其增殖[1]?，F已明確化療能延長一些腦膠質瘤患者的生存期,但效果仍不夠理想。如今化療藥物種類繁多,選擇敏感的化療藥物,對保證化療的療效具有重要意義。本研究應用組織培養藥敏檢測法比較腦膠質瘤5種常用化療藥物的體外抗腫瘤作用。在實施化療前了解患者病灶對不同化療藥物的敏感和耐受性,旨在為臨床篩選化療藥物及制訂化療方案提供參考[2]。

1 臨床資料

1.1 一般資料 59份標本均來自2007年1月至2009年1月本科收治的患者,術后病理診斷均為星型膠質細胞瘤。其中男37例,女 22例;年齡24～71歲,平均(41.6±12.0)歲。 按照WHO中樞神經系統腫瘤分類標準:Ⅰ級6例,Ⅱ級13例,Ⅲ級29例,Ⅳ級11例。

1.2 試劑 標本除菌洗滌液為含雙抗的無血清RPMI-1640培養液,青霉素和鏈霉素濃度均為100 u/mL。組織培養液為含10%小牛血清的RPMI-1640培養液。噻唑藍(M TT)溶液濃度為10 mg/mL,用生理鹽水配制,濾膜過濾除菌后裝瓶備用,4℃避光保存?；熕幬锛跋鄳獫舛?洛莫司汀(CCNU)10 μ g/mL、福莫司汀(FCNU)10 μ g/mL、替尼泊甙(VM26)20 μ g/mL、尼莫司汀(ACNU)6.5 μ g/mL 及替莫唑胺(TMZ)7 μ g/mL。所采用的藥物濃度均為說明書提示的血漿峰濃度。配藥溶劑均使用滅菌注射用水。

1.3 組織培養藥敏檢測法 本研究采用組織塊培養-終點染色-計算機圖像分析法(tissue culture-end point staining computer image analysis,TECIA),組織培養采用四孔同步法,以保證組織塊的存活及培養成功。本研究中標本系手術中取材,立即送入實驗室,保證了標本的新鮮,減少了污染,培養成功率大于80%,即四孔培養基中平均有3孔以上存活。依據梁永鉅等[3]報道的方法,用 TECIA分析軟件計算化療藥物抑制率(IR)。化療藥物敏感性以抑制率作為評價標準。參照Singh等[4]的研究,抑制率在 30%以上為敏感,低于30%為耐藥。

1.4 統計學處理 應用SPSS11.5 for Windows統計軟件。腦膠質瘤標本對各種藥物敏感性的比較,性別、年齡、病理分級與各種藥物敏感性的相關性分析均采用χ2檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 化療藥物敏感性的比較 ACNU最敏感,為(43.3±10.6)%;其次是 VM26,為(42.5±7.4)%;CCNU 為(34.6±16.2)%;FCNU為(31.1±8.3)%;TMZ的敏感性最低,為(29.2±15.3)%。ACNU和VM26與其它各組藥物敏感性差異有統計學意義(χ2=12.045,P＜0.05),明顯優于其他3種單藥;進一步兩兩比較,ACNU敏感性與VM26敏感性差異無統計學意義,CCNU、FCNU和TMZ之間的敏感性差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 性別、年齡和病理類型與各種藥物敏感性的關系 CCNU和FCNU的藥物敏感性與性別有一定相關性,差異有統計學意義(P＜0.05),而其余各藥差異無統計學意義(P＞0.05)。將59例患者分為小于或等于40歲和大于40歲兩組,與各種藥物的敏感性進行比較,統計結果顯示:各組藥物的敏感性與年齡之間差異無統計學意義(P＞0.05)。依據WHO膠質瘤分類標準,對腫瘤惡性程度進行分級,按病理類型分為小于或等于Ⅱ級與大于Ⅱ級兩組,并與各種藥物的敏感性進行比較,經χ2檢驗,各組藥物的敏感性與病理分級差異無統計學意義(P＞0.05),見表 1。

表1 性別、年齡和病理類型與各種藥物敏感性的關系(n)

3 討 論

在化療前進行體外腫瘤化療藥物敏感性試驗來篩選最有效的化療藥物,對于提高腫瘤治療效果、減輕因盲目應用抗腫瘤藥物不良反應均具有重要意義。目前,在進行體外藥敏試驗時,大多是在細胞系上進行的,但是,細胞系的組織學特性與活體腫瘤細胞有一定差異。

由于在本院進行的腦膠質瘤化療是采用經股動脈介入行選擇性頸內動脈或椎動脈灌注,一般為單藥化療,因此選用一種治療效果比較好的抗腫瘤藥物顯得尤為重要。本研究所選的5種藥物均為目前臨床上治療惡性腦腫瘤常用的化療藥物。

ACNU為亞硝基脲類藥物,具有烷基化作用,能使DNA低分子化,抑制DNA和RNA的合成,從而發揮抗腫瘤作用,并可透過血腦屏障[5]。VM26為鬼臼毒素衍生物,屬于拓撲異構酶抑制劑,為周期特異性細胞毒藥物,抑制拓撲異構酶Ⅱ,引起DNA斷裂,阻斷有絲分裂于細胞周期S期和G2期。CCNU為細胞周期非特異性藥物,對處于G1～S期邊界,或 S期早期的細胞最敏感,對G2期也有抑制作用。進入體內后其分子從氨甲酰胺鍵處斷裂為兩部分,一為氯乙胺部分,發揮烴化作用,使DNA鏈斷裂,RNA及蛋白質受到烴化,這與抗腫瘤作用有關;另一部分為氨甲?；糠职l揮氨甲酰化作用,主要與蛋白質特別是其中的賴氨酸末端的氨基等反應,這主要與骨髓毒性作用有關,氨甲酰化還破壞一些酶蛋白使DNA被破壞后難以修復,這有助于抗癌。該藥與烷化劑無交叉耐藥[6]。TMZ為咪唑并四嗪類具有抗腫瘤活性的烷化劑。在體循環生理pH狀態下,迅速轉化為活性產物3-甲基-(三嗪-1-)咪唑-4-甲酰胺(M TIC)。MTIC的細胞毒作用主要表現為DNA分子上鳥嘌呤第6位氧原子上的烷基化以及第7位氮原子的烷基化。通過烷基化加成反應的錯配修復,發揮細胞毒作用[7]。FCNU為亞硝基脲類中的抑制細胞增殖的抗腫瘤藥物,具有烷基化和氨甲?；钚?及實驗性的廣譜抗腫瘤活性。其化學結構式含有一個丙氨酸的生物電子等配體(氨基-1-乙基磷酸),使其容易穿透細胞及通過血腦屏障[8]。本研究結果顯示:ACNU的敏感率最高(43.3%),其次是VM26(42.5%),兩者敏感性無顯著差異,但明顯優于其他3種藥物CCNU(34.6%)、FCNU(31.1%)和TMZ(29.2%)。

離體組織培養法(histoculture drug response assay,HDRA)是一種基于非分散性組織的藥敏檢測技術,該技術將微小的組織塊培養于海綿狀膠原凝膠基質上,同時加入抗癌藥物作用一定時間,細胞活性終點評價采用MT T還原法。由于單細胞的體外生存環境與體內實體瘤中的環境差別很大,組織培養法與單細胞法相比,能夠保持實體瘤在體內的三維生長方式、組織結構、細胞異質性和致瘤性等多種特性,并能模擬體內實體瘤細胞的環境,提高藥敏檢測的準確性,是一種較實用的微量化體外藥敏檢測方法,具有很好的臨床應用前景。有研究證明,該藥敏檢測法的結果和臨床效果的相關率達到92.1%[9]。本研究基于上述HDRA法原理采用的組織培養藥敏檢測法,應用圖像分析技術,檢測了59份腦膠質瘤標本的化療藥物敏感性,發現不同個體對同一藥物及同一個體對不同藥物的敏感性差異較大,抑制率最高達53.9%,最低為13.9%。

目前臨床上腦膠質瘤的化療方法多為經驗性化療,主要依據患者的臨床情況及文獻報道。本研究進一步對可能影響藥敏檢測結果的患者臨床因素,如性別、年齡、病理分級進行了相關性分析,未發現藥物的敏感性與年齡有關,FCNU和CCNU的敏感性與性別有關.其他藥物的敏感性與年齡、性別、病理分級無明顯相關。全世界12個惡性腦膠質瘤化療的隨機對照研究(3 004例患者)發現腦膠質瘤的化療效果與年齡、性別、組織類型、機能狀態和手術切除范圍均無相關性[10]。因此,臨床上為腦膠質瘤患者制訂個體化的化療方案時需要了解患者對化療藥物敏感或耐受的客觀指標。腫瘤的體外藥敏試驗已有數十年的歷史,大量研究表明,體外藥敏檢測與臨床療效存在良好相關性,一般化療藥物的體外敏感與體內有效的符合率為50%～70%,體外耐藥與體內無效的符合率為 85%～95%[11]。

由于藥物在體外與體內的作用條件不同,體外試驗不能完全模擬體內作用的復雜過程,體外藥敏檢測為敏感的藥物,在體內并不一定有效。但如果藥物在體外不能抑制腫瘤組織生長,其在體內的作用效果必然不理想。根據本研究的結果可以認為ACNU是目前單藥化療方案中最有效的抗腫瘤藥物。

隨著對腦膠質瘤分子病理學特征及其耐藥機制的逐步認識,根據體外藥敏的檢測結果和耐藥相關基因的表達情況,對于將來指導臨床腦膠質瘤的個體化治療具有重要價值。

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