人腦干和幕上膠質(zhì)瘤N-cadherin和β-catenin mRNA的表達(dá)

馬俊艷,武文浩,田永吉,歷俊華,張力偉,萬虹,郝淑煜,李德志,陰魯鑫

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,其中腦干膠質(zhì)瘤是惡性程度較高的腫瘤,比其他部位膠質(zhì)瘤侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差。臨床研究發(fā)現(xiàn),腦干膠質(zhì)瘤絕大多數(shù)呈彌漫性生長,而幕上膠質(zhì)瘤往往呈局限性生長,并且幕上膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后明顯好于腦干膠質(zhì)瘤,但其中的具體機(jī)制目前仍不清楚。近年來,N-cadherin和相關(guān)因子β-catenin在膠質(zhì)瘤侵襲性的發(fā)生及發(fā)展中的重要作用已成為研究的熱點(diǎn)[1-3]。本文擬采用RT-PCR方法分別檢測N-cadherin和β-catenin mRNA在腦干和幕上膠質(zhì)瘤中的表達(dá),探討N-cadherin和β-catenin及其復(fù)合體在腦干和幕上膠質(zhì)瘤發(fā)病中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬天壇醫(yī)院神經(jīng)外科顱底腦干病區(qū)2008年1月～2009年11月手術(shù)切除的18例腦干膠質(zhì)瘤和18例幕上膠質(zhì)瘤標(biāo)本,均經(jīng)病理科診斷確診。標(biāo)本離體后均立即保存于液氮罐中。病例中男性23例,女性13例,平均年齡37歲。根據(jù)1999年WHO確定的病理分級標(biāo)準(zhǔn)將其劃分為4級:Ⅰ級1例、Ⅱ級19例、Ⅲ級 3例、Ⅳ級13例。其中低級別(Ⅰ～Ⅱ級)腦干和幕上膠質(zhì)瘤各10例,高級別(Ⅲ～Ⅳ級)腦干和幕上膠質(zhì)瘤各8例。

總RNA提取液TRIzol:北京金馳同信科技發(fā)展有限公司;引物:Invitrogen Biotechnology Co.,Ltd;PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒及DNA Marker:TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

取樣本100 mg,研磨后用 TRIzol法提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性,DNA核酸分析儀測OD260/OD280比值(1.9～2.1),計算核酸濃度。RTPCR反應(yīng)按TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒說明書操作:5 μ g 模板 RNA 、20 μ l RT 體系 、50 μ l PCR體系。

引物序列 :N-cadherin:上游:5′-GTG CCA T TA GCC AAG GGA AT T CAG C-3′;下游 :5′-GCG TTC CTG TTC CAC TCA TAG GAG G-3′;β-catenin:上游 :5′-ACC TCC CAA GTC CTG TAT GAG TG-3';下游 :5′-CAT CTG AGG AGA ACG CAT GAT-3′;GAPDH(內(nèi)參):上游 :5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′;下游:5′-TTG AT T TTG GAG GGA TCT CG-3′。

PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃、5 min,變性94℃、30 s,退火53 ℃、45 s,延伸 72 ℃、45 s,共進(jìn)行30個循環(huán),最后延伸72 ℃、10 min。

1.2.2 RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物相對定量分析 每一樣本以管家基因GAPDH作為內(nèi)參照。RT-PCR結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳結(jié)果用Gel-Pro凝膠分析系統(tǒng)行掃描及灰度分析,對陽性電泳條帶進(jìn)行吸光度峰值下面積積分,每一樣本計算N-cadherin和βcatenin與GAPDH條帶吸光度積分的比值,此值為各樣本mRNA的相對量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對 N-cadherin和β-catenin在不同病理級別、不同部位膠質(zhì)瘤之間的比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。對N-cadherin和β-catenin在腦干和幕上膠質(zhì)瘤中的相互關(guān)系采用相關(guān)分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 N-cadherin 在高級別腦干膠質(zhì)瘤中,5例標(biāo)本呈強(qiáng)陽性表達(dá),3例呈中等強(qiáng)度表達(dá);在低級別腦干膠質(zhì)瘤中,7例呈中等強(qiáng)度表達(dá),3例呈弱陽性表達(dá)。在高級別幕上膠質(zhì)瘤中,2例標(biāo)本呈強(qiáng)陽性表達(dá),3例呈中等強(qiáng)度表達(dá),3例呈弱陽性表達(dá);在低級別幕上膠質(zhì)瘤中,2例呈強(qiáng)陽性表達(dá),3例呈中等強(qiáng)度表達(dá),5例呈弱陽性表達(dá)(圖1)。N-cadherin mRNA在腦干和幕上膠質(zhì)瘤中的表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05);在幕上膠質(zhì)瘤高低級別間的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05);在腦干膠質(zhì)瘤高低級別間有顯著性差異(t=2.711,P＜0.05)。見表1。

2.2 β-catenin 在高級別腦干膠質(zhì)瘤中,5例標(biāo)本呈強(qiáng)陽性表達(dá),3例呈中等強(qiáng)度表達(dá);在低級別腦干膠質(zhì)瘤中,2例標(biāo)本呈強(qiáng)陽性表達(dá),6例呈中等強(qiáng)度表達(dá),1例呈弱陽性表達(dá)。在高級別幕上膠質(zhì)瘤中,5例標(biāo)本中等強(qiáng)度表達(dá),3例呈弱陽性表達(dá);在低級別腦干膠質(zhì)瘤中,2例標(biāo)本呈強(qiáng)陽性表達(dá),3例呈中等強(qiáng)度表達(dá),5例呈弱陽性表達(dá)(圖2)。β-catenin mRNA在腦干膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于幕上膠質(zhì)瘤(t=2.255,P＜0.05)。βcatenin mRNA在腦干和幕上各級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 N-cadherin和β-catenin與GAPDH電泳條帶的面積積分比值

圖1 N-cadherin RT-PCR電泳結(jié)果

圖2 β-catenin RT-PCR電泳結(jié)果

2.3 相關(guān)性分析 N-cadherin和β-catenin mRNA在腦干(r=0.480)和幕上(r=0.809)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)均呈正相關(guān)(均P＜0.05)。

3 討論

腦干是人體生命中樞,由于腦干解剖結(jié)構(gòu)和功能的特殊性,目前對腦干膠質(zhì)瘤的研究只限于臨床觀察。本研究首次從轉(zhuǎn)錄水平研究比較了腦干和幕上膠質(zhì)瘤中N-cadherin和β-catenin的表達(dá),對腦干膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性作了初步探討。

N-cadherin分子量約為130 kDa,主要分布于神經(jīng)和肌肉組織,是一類介導(dǎo)細(xì)胞間同質(zhì)黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白,在神經(jīng)軸突的導(dǎo)向生長、靶向識別以及突觸形成中起重要作用,多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分參與上述過程的調(diào)控。目前對于膠質(zhì)瘤中N-cadherin的研究,國外文獻(xiàn)報道并不一致。Asano等研究發(fā)現(xiàn),N-cadherin表達(dá)的減少與膠質(zhì)瘤侵襲行為增強(qiáng)和腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān),并認(rèn)為 N-cadherin表達(dá)與周邊浸潤呈負(fù)相關(guān)[4]。而Utsuki等發(fā)現(xiàn),N-cadherin表達(dá)的增加與膠質(zhì)瘤侵襲行為增強(qiáng)有關(guān)[5]。體外實(shí)驗(yàn)表明,給N-cadherin表達(dá)陰性的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染N-cadherin后,細(xì)胞的侵襲性明顯增強(qiáng)[6]。國內(nèi)文獻(xiàn)報道均認(rèn)為,N-cadherin的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤級別的升高而增高[7]。但目前關(guān)于N-cadherin表達(dá)變化的具體機(jī)制以及在腦干膠質(zhì)瘤中的表達(dá)報道較少。本研究首次從轉(zhuǎn)錄水平檢測了腦干和幕上膠質(zhì)瘤中N-cadherin mRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在腦干和幕上膠質(zhì)瘤中N-cadherin mRNA的表達(dá)無顯著差異,而高級別腦干膠質(zhì)瘤中N-cadherin mRNA表達(dá)量顯著高于低級別腦干膠質(zhì)瘤;臨床研究表明,腦干膠質(zhì)瘤絕大多數(shù)呈彌漫性生長;推測N-cadherin與腦干膠質(zhì)瘤的病理分級及較強(qiáng)侵襲性關(guān)系密切。

β-catenin分子量為92 kDa,是原癌基因編碼的黏附蛋白,主要調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附系統(tǒng),影響組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生;此外,β-catenin還是 Wnt信號傳導(dǎo)通路的重要成分。有研究表明,β-catenin具有致癌作用,是癌細(xì)胞增殖的重要促進(jìn)因子,隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高,β-catenin的表達(dá)亦增高[8-9]。Pu等對45例不同級別的膠質(zhì)瘤進(jìn)行 RT-PCR檢測,結(jié)果顯示,β-catenin基因在各級膠質(zhì)瘤中的mRNA表達(dá)無顯著性差異[10]。本實(shí)驗(yàn)研究了腦干和幕上膠質(zhì)瘤中β-catenin mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示β-catenin mRNA在腦干膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著高于幕上膠質(zhì)瘤,提示β-catenin是導(dǎo)致腦干膠質(zhì)瘤較幕上膠質(zhì)瘤侵襲性較強(qiáng)的關(guān)鍵因素之一;此外,雖然在高低級別腦干膠質(zhì)瘤中β-catenin mRNA的表達(dá)無顯著差異,但β-catenin mRNA在高低級別腦干膠質(zhì)瘤的表達(dá)均有增強(qiáng)的趨勢,可能表明其與腦干膠質(zhì)瘤的惡性增殖活性有關(guān)。但造成腦干膠質(zhì)瘤預(yù)后差的主要原因是由于腫瘤本身的侵襲性還是其特殊的解剖結(jié)構(gòu)遭到破壞所致,還需進(jìn)一步研究。

細(xì)胞黏附性的改變是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的重要始動環(huán)節(jié)。β-catenin與cadherin家族連接形成cadherincatenin功能復(fù)合體,調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,β-catenin與N-cadherin在腦干和幕上膠質(zhì)瘤中的mRNA表達(dá)均呈正相關(guān),提示N-cadherin-β-catenin復(fù)合體在腦干和幕上膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為中都起著重要作用。但N-cadherin與β-catenin在不同部位膠質(zhì)瘤中表達(dá)為何差異較大,還需進(jìn)一步研究。

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