COPD骨骼肌功能障礙與PPARα基因多態性關系研究*

龍翔宇,傅煒萍,何大川,劉 華,張劍青,舒敬奎,戴路明△

(昆明醫學院第一附屬醫院:1.重癥呼吸科;2.檢驗科,昆明650031)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以氣流不可逆受限為特征的慢性氣道疾病[1],同時也是一種涉及多器官受損的全身疾病。全身主要癥狀表現為心血管、神經系統受累及骨骼肌功能障礙(skeletal muscle dysfunction,SMD)[2]。人們一直以為COPD患者出現運動受限,主要是因為肺功能受損所致。但近年來越來越多的研究發現,在運動受限的COPD患者中,約40%左右患者的肺功能并沒有嚴重受損,而表現為明顯的SMD。過氧化物酶體增殖活化受體α(peroxisome proliferators-activated receptorsα,PPARα)是核受體超家族成員之一,具有抗炎、抗氧化、調節糖脂代謝等功能,并與肌纖維類型有一定關系,目前在COPD SM D研究中受到重視[3]。本實驗系探索性研究,選擇了昆明地區漢族人群為研究對象,探討PPARα基因的5個突變位點:rs45550937(C/G),rs45552534(A/G),rs45576140(C/G),rs45528736(A/G),rs45576734(A/G)的基因突變率與COPD患者SMD的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 所有患者都符合COPD全球倡議標準。所有患者都有不可逆的氣流受限(吸入β2受體激動劑后1 s用力呼氣容積(FEV1)的提升小于預計值的10%或絕對值小于200 mL),所有患者近三周均未使用過全身性的激素。但允許吸入維持劑量的長效激素和(或)支氣管擴張劑(β2受體激動劑或膽堿能受體阻滯劑)。排出標準:COPD患者伴有惡性腫瘤、哮喘、支氣管擴張癥、心功能衰竭、截癱、最近外科手術、肝腎功能不全、內分泌功能障礙及免疫系統性疾病。按照上述標準,最終納入昆明地區COPD患者128例。64例年齡相匹配的健康對照者均無親戚關系,均來自昆明地區。登記所有入選對象的基本資料,包括年齡、性別、吸煙指數、體質量指數(body mass index,BMI)、無脂肪組織指數(fat-free mass index,FFMI,生物電阻抗法測定)、動脈氧分壓(PaO2)和肺功能[FEV占預計值的百分比(FEV1%)、1 s用力呼氣量占用力肺活量比值(FEV1/FVC%)];對 COPD 患者,以 BMI＞21 kg/m2和BMI≤21 kg/m2,且男性以 FFMI＞16 kg/m2和 FFMI≤16 kg/m2,女性以 FFM I＞15 kg/m2和 FFMI≤15 kg/m2的COPD組患者分為SMD組(BMIL組)和無 SMD組(BMIN組)[4]。一般情況及相關檢查見表 1。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取,取外周全血2 mL,EDTA-Na2抗凝,-20℃冰箱保存(不超過6個月)。冰凍血塊室溫解凍后,采用柱式小量血液基因組DNA抽提試劑盒(上海華舜,批號200903),嚴格按說明操作,提取外周血白細胞DNA。所提DNA放入-70℃冰箱中保存備用。

1.2.2 PPARα基因多態性分析 在 PUBM ED上查出PPAR α全序列。5個突變位點相鄰,最長2個突變位點相距為236個堿基。由于直接設計引物有一定難度,故采用巢式多聚酶鏈反應(PCR)方法,用Primer Premier設計引物,一擴引物:上游 5′-CTG CTT CCG AGT CCA T-3′,下 游 5′-AAT AGT GAA GGG TCT TTA GCG-3′,擴增體系:DNA 模 板100～300 ng,引物 10 pmol(上海捷瑞提供,下同),dNTP(10 mmol/L)1 μ L,MgCl2(25 mmol/L)1 μ L,10 ×TaqBuffer with KCL 5 μ L,5.0 IUTaqDNA 聚合酶(均為 Fermentas提供,下同),雙蒸水調整共50 μ L,反應條件為 94℃預變性 5 min;94℃變性60 s,60℃退火60 s,72℃延伸60 s,共35個循環后延伸5 min。產物長度為1 846 bp(圖1)。將一擴產物1 μ L,稀釋 30倍,取 1 μ L,為二擴產物模板。二擴引物:上游 5′-TAG GAA AAG TGG TGA CC-3′,下游 5′-CAA AAG AAT CCA AA T GT T-3′,反應體系:1 μ L稀釋的 DNA模板,引物 10 pmol,dNTP(10 mmol/L)1 μ L,MgCl2(25 mmol/L)1 μL,10 ×TaqBuffer with KCL 5μ L,5.0 IUTaqDNA 聚合酶,雙蒸水調整共50 μ L。反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性60 s,48℃退火60 s,72℃延伸45 s,共38個循環后延伸5 min。產物長度為430 bp。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠鑒定后,外送上海生工測序。

表1 一般情況及相關檢查

圖1 一擴產物結果(1 846 bp)

2 結 果

經過實驗,擴增出所需目的片段(圖2)。共成功測序184例,其中COPD組123例(BMIL組64例,BMIN組59例),健康對照組61例,失敗8例。經比對,在COPD患者BMIL組和健康對照組中,rs45550937(C/G),rs45552534(A/G),rs45576140(C/G),rs45528736(A/G),rs45576734(A/G),5個位點均未發生突變,均為 C、G、C、A、A。所以未對三組間基因型和等位基因進行比較。

圖2 二擴產物結果(430 bp)

3 討 論

COPD是一種以氣流不可逆受限為特征的慢性氣道疾病。但是越來越多的文獻證明COPD不僅單是肺部的疾病,而且是一種涉及肺外表現的系統性的疾病。SMD是COPD的重要并發癥,主要表現為肌力下降、肌耐力的下降,易疲勞。其形成機制非常復雜,與全身炎癥反應、氧化應激、營養代謝、線粒體功能障礙、細胞缺氧以及缺乏身體鍛煉等因素有關,而上述刺激因素均會降低骨骼肌氧化代謝能力,或者使肌蛋白分解/合成過程失衡、影響骨骼肌纖維的凋亡過程,導致SMD[5]。COPD患者的SMD,會進一步惡化患者健康情況,增加醫療費用,影響患者的生活質量,尤其對中、重度COPD患者,骨骼肌的消耗是預計患者死亡率的重要指標[6]。盡管目前臨床上使用支氣管擴張劑和抗炎藥物能改善COPD患者的肺功能,但患者運動受限的癥狀并沒有改善,而目前針對COPD患者骨骼肌萎縮的治療措施,仍然僅局限在運動鍛煉和加強營養方面,這些治療手段對提高運動耐力沒有明顯效果。到目前為止,還不清楚COPD患者肌肉受損的分子機制是疾病特異性因素還是慢性消耗性疾病的共同因素。SMD分子機制的闡述是針對改善COPD患者運動功能和健康狀況的特異性治療很關鍵的一步,對提高患者生活質量非常重要。近年研究發現,一種類固醇激素受體——過氧化物酶體增殖活化受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs),通過介導過氧化物酶體增殖體的活性,調節骨骼肌氧化代謝、促進纖維類型的轉換,參與了COPD疾病SMD的發生[5]。PPARs是核受體超家族成員之一,分為 3種類型:PPAR α、PPA R δ、PPARγ。其中,PPARα基因,位于22號染色體,22q12-q13.1,主要分布于骨骼肌中,對維持肌肉的功能代謝有重要作用。

首先,PPARα與骨骼肌氧化能力及肌纖維類型有關。在骨骼肌中PPARα的主要功能是對脂肪酸β-氧化酶的基因轉錄進行調控,在給予PPAR α激動劑后,肌肉中關于利用脂肪酸的酶的mRNA表達增加。從而增加肌肉組織對脂肪酸的利用,減少糖酵解和乳酸的生成,可增加患者勞動耐力。有證據表明,體育鍛煉可增加肌肉中 PPARα蛋白的含量。相反,COPD久坐的生活方式,可致 PPARα減少[4];同時,PPARα對肌肉代謝的影響與肌纖維的類型有關,在COPD患者骨骼肌中,Ⅰ型(慢收縮氧化型肌纖維)向Ⅱ型(糖酵解型快收縮肌纖維)的轉換。與Ⅰ型肌纖維相比,Ⅱ型纖維抗疲勞能力較低,這將導致肌耐力的減少。Kramer等[7]發現,PPARαmRNA濃度與Ⅰ型纖維比率呈正相關。其次,不同亞型的PPARs具有強大的抗炎能力。系統性炎癥是COPD發病的始動因素,也是COPD患者體質量下降和肌肉萎縮病因學的一個重要因素。許多炎癥應答是通過NF-κ B介導的。PPARα可抑制 NF-κ B驅動的炎癥因子轉錄從而減弱炎癥應答。在實驗小鼠的很多組織中,PPARα的激活可有效地減少NF-κ B激活所致的炎癥因子(如IL-6、TNF-α)的產生[8]。在 COPD患者中,Remels等[8]發現,血中炎癥因子的水平與股外側肌肉中 PPARα的mRNA水平負相關。大量的研究表明,PPARα具有減弱或抑制氧化性應激作用。在COPD患者,氧應激不僅是系統性的,而且在局部骨骼肌亦存在。實驗研究表明,活性氧族(ROS)可增加骨骼肌蛋白分解,抑制肌肉特異性蛋白的表達,增加肌肉細胞的凋亡。此外,有研究表明,在COPD骨骼肌中,硝化應激的標志是增加的[9]。通過直接阻止ROS基因表達,PPAR α激動劑能直接減弱氧化性應激和硝化應激[4];而且,ROS的產生與線粒體膜電位有關,膜電位與線粒體膜上解偶聯蛋白3(UCP3)的表達有關,UCP3基因的上游有PPARα作用元件。故PPARα亦可通過調節 UCP3基因來調節ROS的產生[10]。

近年來對PPARα基因的研究主要集中在與代謝性疾病的關系上,已經發現 PPA R α基因多態性與冠心病、2型糖尿病的發病有關[11-12]。國外多篇文獻表明,PPARs各亞型的含量和活性的減少與COPD SMD明顯相關,這是非常具有吸引力的。目前多項研究證實,PPARα可減弱或抑制氧化性應激,對代謝有強大的調節能力,有潛在的抗炎能力。因此推測,PPAR α激動劑或許可能成為治療 COPD患者的一個靶標[4,13]。基于上述研究,本研究假設PPARα基因多態性與骨骼肌組織中PPARα蛋白含量及活性有關,從而與COPD SMD相關。但目前很少有人研究PPARα的多態性與COPD患者SM D的關系,且本實驗所選5個突變位點的突變概率及其臨床意義在國內外均未見報道。本研究證實,上述5個突變位點在昆明地區漢族人群突變概率低,與COPD SMD無明顯關系。需要進一步篩查PPARα基因的其他突變位點的多態性與COPD患者SMD的關系。

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