微生物降解農藥的研究進展

楊明偉, 葉 非

(東北農業大學理學院,哈爾濱 150030)

隨著農藥工業的發展,大規模使用化學農藥所帶來的環境問題日益嚴重,研究者們相繼對除草劑、殺蟲劑、殺菌劑、殺線蟲劑的微生物降解進行了深入細致的研究,近幾十年工作發現微生物對土壤和水環境的農藥降解起主要作用,已分離出一批能降解或轉化某些農藥的微生物類群,并探討了微生物降解農藥的主要作用方式及降解機制,以及各類化學農藥微生物降解的途徑[1-3]。本文綜述了近年來農藥生物降解的研究進展,提出存在的問題和發展趨勢。

1 降解農藥的微生物類別

已報道的降解農藥的微生物有細菌、真菌、放線菌、藻類等,大多數來自土壤微生物類群。細菌由于其生化上的多種適用能力以及容易誘發突變菌株從而占了主要的位置,其中假單胞菌屬是最活躍的菌株,對多種農藥有分解作用。圖1列舉了主要的降解農藥的微生物類別[4]。

圖1 降解農藥的微生物類別

2 微生物降解農藥的途徑與機理

目前,對于微生物降解農藥的研究主要集中于細菌。細菌降解農藥的本質是酶促反應,即化合物通過一定的方式進入細菌體內,然后在各種酶作用下,經過一系列的生理生化反應,最終將農藥完全降解或分解成分子量較小的無毒或毒性較小化合物的過程。如假單胞菌ADP菌株以莠去津為唯一碳源,有3種酶參與了降解莠去津的前幾步反應,首先是AtzA酶催化莠去津水解脫氯的反應,得到無毒的羥基莠去津,該酶是莠去津生物降解的關鍵酶;其次是AtzB酶催化羥基莠去津脫氯氨基反應,產生N-異丙基氰尿酰胺;第3步是AtzC酶催化N-異丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和異丙胺;最終莠去津被降解為CO2和NH3[5]。由于降解酶往往比產生該類酶的微生物菌體更能忍受異常環境條件,酶的降解效率遠高于微生物本身,所以利用降解酶可以作為凈化農藥污染的有效手段。但是,降解酶在土壤中容易受非生物變性、土壤吸附等作用而失活,難以長時間保持降解活性,并且酶在土壤中的移動性差等因素,限制了降解酶在實際中的應用。試驗已經證明,編碼合成這些酶系的基因多數在質粒上,如2,4-D的生物降解,即由質粒攜帶的基因所控制,通過質粒上的基因與染色體上的基因的共同作用,在微生物體內把農藥降解[6]。

目前對于各種殺蟲劑的微生物降解途徑已比較清楚,表1列舉了幾種主要的降解途徑[7]。

表1 微生物降解農藥的主要途徑

3 影響微生物降解農藥的因素

3.1 微生物自身的影響

微生物的種類、代謝活性、適應性等都直接影響到對農藥的降解與轉化。已經證明,不同的微生物種類或同一種類的不同菌株對同一有機底物或有毒金屬的反應都不同。Kumar等[15]研究了Bacillus circulans-I,B.circulans-II和Staphylococcussp.3種不同細菌對硫丹的降解,研究表明：3種細菌純系培養 14d后,對α-硫丹的降解率分別為93.3%±0.15%,93.4%±0.15%和 89.95%,對 β-硫丹的降解率分別為75.96%±0.05%,76.73%±0.05%和82.9%±0.05%。

微生物具有較強的適應和被馴化的能力,通過一定的適應過程,新的化合物能誘導微生物產生相應的酶系來降解,或通過基因突變等建立新的酶系來降解。微生物降解本身的功能特性和變化也是最重要的因素。陳歡林[16]指出真菌的代謝方式十分特殊,真菌細胞通過分泌胞外酶將潛在的食物分解,然后再吸收進入細胞,具有很強的分解能力。其中,白腐真菌對很多有毒污染物具有降解轉化作用,為生物降解開拓了一條新的途徑。白腐真菌的特異耐毒性,使其對毒性大的有機氯化物(如滴滴涕、林丹、氯丹等)也具有廣譜降解能力。Huang等[17]研究表明Boletusedulis,Gomphidiusviscidus,Laccaria bicolor和Leccinumscabrum等4種白腐真菌對滴滴涕具有降解能力。

微生物因其自身的生活習性不同,對不同農藥的降解有著完全不同的結果,這也是研究人員普遍關心的問題,隨著人們對微生物了解的深入,農藥降解的研究也會取得長足發展。

3.2 農藥結構的影響

農藥化合物的分子量、空間結構、取代基的種類及數量等都影響到微生物對其降解的難易程度。不同化學結構的農藥,生物降解性由易到難依次為脂肪酸類、有機磷酸鹽類、長鏈苯氧基脂肪酸類、短鏈苯氧基脂肪酸類、單基取代苯氧基脂肪酸類、三基取代苯氧基脂肪酸類、二硝基苯類、氯代烴類[18]。一般情況下,高分子化合物比低分子量化合物難降解,聚合物、復合物更能抗生物降解[19];空間結構簡單的比結構復雜的容易降解[20];易溶于水的農藥比難溶于水的農藥易降解[21]。陳亞麗等[22]在試驗中發現,凡是苯環上有-OH或-NH2的化合物都比較容易被假單胞菌WBC-3所降解,這與苯環的降解通常先羥化再開環的原理一致。Potter等[23]在小規模堆肥條件下研究了多環芳烴的降解后指出,2-4環的芳烴比5-6環的芳烴容易降解。虞云龍[24]的研究表明,降解菌對擬除蟲菊酯和一硫代膦酸酯殺蟲劑的降解速率的差異主要是由它們的疏水性參數(lgKow)引起的。但是,并非lgKow越小降解速率越大,氯代酚等化合物的微生物降解速率先隨著疏水性的降低而增大,疏水性進一步降低降解速率又減小,說明有機化合物對細胞膜的穿透要求合適的疏水性。

微生物只能降解特定結構的農藥,所以農藥結構決定降解該農藥的微生物種類,只有對污染環境農藥的結構充分了解,才能有效地對其進行生物降解。

3.3 環境因素的影響

環境因素包括溫度、酸堿度、營養、氧、底物濃度、表面活性劑等。Sarfraz等[25]研究了假單胞菌Pseudomonasspinosa,P.aeruginosa和Burkholderiacepacia對硫丹的降解,證明了溫度和pH對微生物降解硫丹的影響,指出上述三菌株降解硫丹的最佳溫度為30℃,pH為8.0。Athanasios等[26]研究了敵草隆的微生物降解,指出其好氧降解為60%,降解產物為DCA,厭氧降解則超過95%,降解產物為DCPU。Rhodes[27]研究了不同土壤對2,4-二氯苯酚降解的影響,發現微生物或其產生的酶系降解農藥都需要適宜的溫度、pH及底物濃度。

Hundt等[28]調查了芳香基化合物在土壤中和堆肥中被細菌Ralstonia和Pickettii降解及礦化情況,在土壤水分適宜的條件下,非離子型表面活性劑吐溫80可增強微生物對芳香基化合物的利用率。Kastner等[29]認為,在堆肥與被多環芳烴污染的土壤混合的情況下,堆肥中有機基質含量對于農藥降解的作用要大于堆肥中生物的含量對于農藥降解的作用;營養對于以共代謝作用降解農藥的微生物更加重要,因為微生物在以共代謝的方式降解農藥時,并不產生能量,需其他的碳源和能源物質補充能量。

農藥的生物降解是一個復雜的過程,影響因素很多。近年來,人們越來越多地關注到環境對農藥的生物降解的影響,取得了很多成果,在今后的研究中,尤其在農藥生物降解實際應用中,環境因素將是人們必須考慮的因素。

4 農藥微生物降解的新技術和新方法

4.1 固定化微生物技術在農藥降解中的應用

自20世紀70年代后期以來,固定化微生物的研究迅速發展,其應用范圍很廣。其中,應用固定化微生物技術降解污水中的農藥,成為一個新的研究領域。Jiyeon等[30]利用海藻酸鈣固定微生物,對蠅毒磷的降解進行試驗,取得了滿意的結果,其降解能力優于未固定化微生物。Quan等[31]用蜂窩狀航空陶瓷包埋固定無色桿菌Achromobactersp.,制成流動床來降解2,4-D,去除率達87.9%～100%。

由于固定化細胞對底物和氧氣擴散有阻礙,使細胞酶活性降低,通過基因工程手段制備高效工程菌是解決該問題的關鍵。閆艷春等[32]克隆抗性庫蚊酯酶基因并在大腸桿菌中高效表達,用海藻酸鈉包埋固定此工程菌,并處理有機氯農藥三氯殺蟲酯和菊酯類農藥溴氰菊酯,結果表明,固定化工程菌能高效降解這兩種農藥。

4.2 農藥降解酶制劑的研制及應用

如果用微生物產生的酶來處理農藥殘留而不是直接使用微生物菌株,那么對環境造成威脅或潛在威脅的風險即可降低。研究表明,一些酶比產生這類酶的微生物菌體更能忍受變異的環境條件,如對硫磷水解酶可耐受高達10%的鹽濃度和50℃的溫度,而產生這種酶的假單胞菌在這種條件下卻不能生長[33]。固化酶對環境條件有較寬的忍受范圍,可用于農藥及類似結構的環境污染物的凈化。用降解酶凈化農藥具有良好的效果,能否應用取決于穩定性及固定化技術的實用性,降解酶的獲得可通過生物技術對降解農藥的基因進行克隆、基因的高效表達來實現。

4.3 降解基因的克隆、表達及基因工程菌的構建

分子生物學的迅猛發展為農藥降解菌從實驗室走向實際應用提供了可能。人們寄希望通過基因工程技術將農藥降解酶基因或降解質粒克隆到合適的宿主菌中并使其高效表達,構建“高效農藥降解菌”,為農藥的微生物降解開辟一條新途徑。這一領域已成為當今環境生物技術的研究熱點之一,也是今后工作的重點。Richard等[34]構建的帶有有機磷水解酶基因的工程大腸桿菌能夠快速降解有機磷農藥。沈標等[35]采用三親接合法成功地將帶有 luxAB基因的 Ptr102質粒轉入甲基1605降解菌DLL-1中,獲得的接合子熒光非常強,而且標記質粒非常穩定。此外,除草劑2,4-D降解質粒、莠去津降解酶基因等已成功地克隆表達[36]。

5 存在的問題及展望

目前已相繼分離和鑒定了各種降解農藥的微生物菌株(包括細菌、真菌等),但是利用微生物進行生物修復的實際應用卻往往由于其降解效率較低而受到影響。農藥微生物降解的問題主要有以下幾方面：(1)單一菌株的純培養問題;(2)環境條件對微生物降解農藥的影響;(3)微生物降解目標化合物對降解的影響;(4)微生物與被降解物接觸的難易程度;(5)微生物的適應性問題。因此,農藥降解菌從實驗室到實際應用還有一段路要走。

微生物降解農藥的研究方向包括：高效農藥降解工程菌的開發、混合菌的培養、降解菌的固定化、白腐真菌降解農藥的研究和農藥生物降解的模型定量化研究。近年來,伴隨著基因工程和分子生物學研究技術的發展,科研工作者開始把重心轉移到高效工程菌的構建,采用基因重組技術,將表達高效降解農藥的酶的基因構建到載體中,經轉化獲得工程菌,以期提高起降解作用的特定蛋白質或酶的表達水平,從而提高降解效率,既能克服一些酶在環境中不能穩定存在的問題,又保持了酶的高活性。隨著基因工程進一步發展,微生物在農藥降解方面的潛力會得到更充分的體現。

[1]Barragán H C,Costa P J,Peralta C J,et al.Biodegration of o rganoch lorine pesticides by bacteria grown in microniches of the porus structu re of green bean coffee[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2007,59(3)：239-244.

[2]Li X H,Jiang JD,Gu L F,et al.Diversity of ch lorpyrifosdegrading bacteria isolated fromch lorpyrifos-contaMinated saMples[J].In ternational Biodeterio ration&Biodegradation,2008,62(4)：331-335.

[3]Wen JP,Li H M,Bai J,et al.Biodegradation of 4-chlorophenol by candida albicans PDY-07 under anaerobic conditions[J].Chinese Journal of CheMical Engineering,2006,14(6)：790-795.

[4]魏敏,李玉江.微生物降解土壤殘留農藥的研究進展[J].山東化工,2007,36(3)：15-18.

[5]張宏軍,崔海蘭,周志強,等.莠去津微生物降解的研究進展[J].農藥學報,2002,4(4)：10-16.

[6]崔中立,李順鵬.化學農藥的微生物降解及其機制[J].江蘇環境科技,1998,11(3)：1-5.

[7]孫建光,姜瑞波,任天志,等.我國農田和水體污染及微生物修復前景[J].中國農業資源與區劃,2008,29(1)：41-47.

[8]Kenneth D R,Kent P S,Robin N Y,et al.Facto rs affecting the hydrolytic deg radation of ch lorpyrifos in soil[J].J Agric Food Chem,1996,44(6)：1582-1592.

[9]Jacobus S,John E R.Reductive dehalogenation of dichloroanilines by anaerobicMicroorganisMs in fresh and dichlorophenolacclimated pond sediment[J].Ap plied and Environmen tal Microbiology,1989,55(10)：2527-2531.

[10]Eva MT,Mphekgo PM,Marleen C,et al.Methane oxidation as amethod to evaluate the removal of 2,4-dichlorophenoxyactic acid(2,4-D)fromsoil by plasMid-mediated bio-augmentation[J].FEMSMicrobiology Ecology,1998,28(3)：203-213.

[11]Ju lie L E,Perry J G,James E G.K inetics of in vitro nitro reduction of 2,4-dinitrophenol by rat liver hoMogenates[J].Toxicology and Applied Pharmacology,1974,27(1)：140-144.

[12]Law W M,LauW N,Lo K L,et al.Removal of biocide pentachlorophenol in water systeMby the spent mushrooMcompost of P leurotus pulmonarius[J].Chemosphere,2003,52(9)：1531-1537.

[13]Bernhard MB.Parameters influencing biotransfo rMation rates of phenylurea herbicides by soilMicroorganisms[J].Pesticide BiocheMistry and Physiology,1998,60(2)：71-82.

[14]Erick son L E,Lee K H.Degradation of atrazine and related striazines[J].Critical Review s in EnvironMental Control,1989,19(1)：1-14.

[15]Kumar M,Philip L.En richment and isolation of aMixed bacterial culture for comp lete Mineralization of endosu lfan[J].Environ Sci Health B,2006,41(1)：81-96.

[16]陳歡林.環境生物技術與工程[M].北京：化學工業出版社,2003：128.

[17]H uang Y,Zhao X,Luan S J.Uptake and biodeg radation of DDT by 4 ectoMycorrhizal fungi[J].Scien ce of the Total Environment,2007,385(1-3)：235-241.

[18]陳劍虹.環境工程微生物學[M].武漢：武漢理工大學出版社,2003：137.

[19]孔繁翔,尹大強,嚴國安.環境生物學[M].北京：高等教育出版社,2000：211-230.

[20]莫測輝,蔡全英,吳啟堂,等.城市污泥與玉米秸稈堆肥中多環芳烴(PAH s)的研究[J].農業工程學報,2001,17(5)：73-77.

[21]常學秀,張漢波,袁嘉麗.環境污染微生物學[M].北京：高等教育出版社,2000：158.

[22]陳亞麗,張先恩,劉虹,等.甲基對硫磷降解菌假單胞菌WBC-3的篩選及降解性能的研究[J].微生物學報,2002,42(2)：490-497.

[23]Potter C L,G laser JA,Chang LW,et al.Degradation of polynu clear armotic hydrocarbons under bench-scale compost conditions[J].Environmental Science and Technology,1999,33(10)：1717-1725.

[24]虞云龍,陳鶴鑫,樊德方.農藥微生物降解性與農藥疏水性參數間的相關性[J].環境科學學報,1998,18(2)：208-211.

[25]Sarfraz H,Muhammad A,Muhammad S,et al.Biodegradation ofα-and β-endosulfan by soil bacteria[J].Biodegradation,2007,18(6)：731-740.

[26]A thanasios SS,Sevasti K,Georgia G,et al.Diu ron biodegradation in activated sludge batch reactors under aerobic and anoxic conditions[J].W ater Research,2009,43(5)：1471-1479.

[27]Rhodes A H,Ow en SM,Semple K T.Biodeg radation of 2,4-dichlorophenol in the presen ce of volatile organic compound s in soils under differen t vegetation types[J].FEMS Microbiol Lett,2007,269(2)：323-330.

[28]Hund t K,W agner M,Becher D,et al.Effect of selected environMental factors on deg radation and Mineralization of biaryl compounds by BacteriuMralston ia p ickettii in soiland compost[J].Chemosphere,1998,36(10)：2321-2335.

[29]Kastner M,Mahro B.Microbial degradation of polycy cle aromatic hydrocarbons in soils affected by the organic matrix of coMpost[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1996,44(5)：668-675.

[30]Jiyeon H,Cady R E,JaMes R W.Biodegradation of coumaphos,chlorferon,and diethyl-thiophosphate using bacteria imMobilized in Ca-alginate gel beads[J].Bio resource Technology,2009,100(3)：1138-1142.

[31]Quan X C,ShiH C,Zhang YM,et al.Biodegradation of 2,4-dichlorophenol and phenol in an airlift inner-loop bioreactor imMobilized with Achromobacter sp.[J].Separation and Pu rification Technology,2004,34(1-3)：97-103.

[32]閆艷春,喬傳令,周曉濤.一種工程菌的高酶活性及其固定化細胞對農藥的降解[J].中國環境科學,1999,19(5)：461-465.

[33]鄭重.農藥的微生物降解[J].環境科學,1990,11(2)：68-72.

[34]Richard D R,Irina K,Wilfred C.Biodegradation of organophosphorus pesticides by su rface-expressed organophosphorus hyd rolase[J].Natu re Biotechnology,1997,15(10)：984-987.

[35]沈標,洪青,李順鵬.甲基對硫磷降解菌DLL-1的發光酶基因標記及在土壤中的變化[J].農村生態環境,2002,18(1)：16-21.

[36]儀美芹,王開運,姜興印,等.微生物降解農藥的研究進展[J].山東農業大學學報,2002,33(4)：519-524.