Aβ1-42合并IBO誘導阿爾茨海默病大鼠模型的建立和評價1)

陳 民,王 晶,陳歡雪

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進行性記憶障礙和智能衰退為主要臨床特征的中樞神經系統退行性疾病,得名于1907年德國神經病學專家Alois Alzheimer的報道。由于AD的衰老性、多病因性,很難用一種干擾因素造出AD的動物模型,許多研究表明[1-3]多因素造模方法具有對動物產生協同損傷的作用。本實驗采用復合AD模型方法[4]加以改良,即將Aβ1-42和IBO混合液共同注入大鼠海馬,破壞與學習記憶有關的膽堿能系統,同時通過凝聚態Aβ1-42使神經元發生退行性變,以期更好地模擬AD行為學和病理學表現。

1 材料與方法

1.1 動物 選擇SD雄性大鼠75只,鼠齡 18周～22周,體重(280±20)g,由遼寧中醫藥大學實驗動物室提供。大鼠隨機分籠飼養,自由攝食與飲水,室溫 20℃～22℃,相對濕度 50%～70%,維持每日光照12 h。

1.2 主要試劑和設備 Aβ1-42(北京博奧森生物技術有限公司),IBO(Sigma公司,美國),水合氯醛(天津市大茂化學試劑),MT-200M orris水迷宮視頻跟蹤分析系統(成都泰盟科技有限公司),江灣Ⅰ型C腦立體定位儀(上海江灣醫療器械廠),307-6型牙科鉆(上海醫用分析儀器廠),微量注射器 1 μ L(寧波市鎮海三愛機器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 大鼠經M orris水迷宮實驗判定其空間辨別性學習記憶能力,淘汰反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠,將選出來的大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組,每組15只。

1.3.2 AD模型構建 凝聚態 Aβ1-42的制備:將 Aβ1-42肽段 1 mg溶于 100 μ L 無菌生理鹽水配制成 10 μ g/μ L,封口膜封好后,37℃孵育1周使其聚集、老化成為凝聚態。取IBO 1 mg溶于其中,配制成 Aβ1-42和IBO混合液,現用現配。

模型組:大鼠經10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,備頭部皮膚,常規消毒手術區皮膚。無菌下操作,沿顱頂中線做2.0 cm縱向切口,止血,鈍性分離骨膜,暴露至顱骨,根據大鼠顱腦立體定位圖譜[5],對單側海馬區立體定位(位置:前囟后3.5 mm,中線左側旁開3 mm,深度5.5 mm),用牙科鉆鉆開顱骨一小孔(直徑1 mm),垂直插入微量注射器,使針尖自顱骨表面進針5.5 mm至海馬區。5 min內緩慢注入 Aβ1-42和IBO混合液1 μ L,留針 10 min。注射完畢緩慢拔針,于創面處施加消炎粉后縫合皮膚。假手術組:在相同定位下給予大鼠同側海馬區一次性注射1 μL無菌生理鹽水。待大鼠清醒后放回籠中常規飼養。術后給予青霉素鈉鹽5×104U肌注,每日1次,連續3 d,首次倍量。正常組:不做任何處理。

1.3.3 行為學檢測 Morris水迷宮實驗[6]改良。術后2周后對每組實驗大鼠分別進行水迷宮學習記憶行為學檢測,每日1次,連續測試7 d(6 d定位航行,1 d空間探索),通過檢測平均逃避潛伏期,評價其學習記憶成績。水迷宮為一不銹鋼圓形水池,直徑150 cm,高60 cm,內置一與池壁同色的平臺,平臺高40 cm,底面為 6 cm×10 cm。在水池壁按東南、西南、西北、東北四個象限分別標明入水點。將平臺放在東北象限正中距池壁22 cm處,迷宮中含牛奶液面高于安全平臺1 cm,水溫(22±1)℃,加適量奶粉使水呈乳白色,訓練期間環境安靜,迷宮外參照物不變,光線不變。實驗:Morris水迷宮實驗前6 d為定位航行試驗,每只大鼠頸部套紅色綢布。按東南、西南、西北、東北四個象限依次將大鼠面向池壁放入水中,使其自由游泳,自動攝像系統記錄大鼠尋找平臺的時間(即逃避潛伏期),設定120 s為最長逃避潛伏期,120 s后自動停止記錄,此項檢測動物的學習能力。空間探索實驗:實驗第7天為空間探索試驗,定位航行試驗結束后撤掉平臺,將動物分別從東南入水點開始面向池壁將大鼠放入水池,記錄120s內大鼠為搜索平臺而穿過原平臺放置區域的時間與總游泳時間的比例,以及穿過平臺區的次數,此項檢測動物的記憶能力。數據采集和處理由M orris水迷宮圖像自動監視處理系統完成。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析,計量資料用均數±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析進行多組間均數比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 定位航行試驗(見表1)各組大鼠均隨著訓練次數增加,潛伏期越來越短,表明各組大鼠在歷次學習訓練中均已逐漸學會尋找平臺,但學習記憶能力明顯不同。正常組和假手術組大鼠在3 d內就學會尋找平臺,在前3 d潛伏期迅速下降,從第3天起漸趨平穩,約在30 s內能找到平臺;而模型組雖有下降趨勢,但較正常組和假手術組明顯延長,約需95 s才能找到平臺,差異有統計學意義(P＜0.01),說明造模成功。

表1 3組水迷宮實驗平均逃避潛伏期比較(±s)s

表1 3組水迷宮實驗平均逃避潛伏期比較(±s)s

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天正常組 15 40.9±2.4 39.3±1.7 35.5±1.4 35.7±2.6 30.9±2.7 26.6±1.6假手術組 14 41.4±2.5 41.0±3.0 39.0±1.01) 36.8±2.7 32.7±1.3 30.9±3.51)模型組 12 65.3±2.82) 73.2±5.42) 75.9±3.42) 77.0±1.52) 93.3±2.72) 97.3±4.02)與正常組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 空間探索試驗(見表2)各組大鼠在撤除平臺后2 min的空間探索試驗結果:大鼠在原平臺象限游泳的時間越長和跨越平臺象限的次數增多,時間比和次數越大,反映大鼠對原平臺象限的記憶越好。模型組與正常組和假手術組相比,時間比和次數均顯著減小(P＜0.01),說明模型組對原平臺象限的選擇性較低,即造模成功。

表2 各組大鼠空間探索試驗結果(±s)

表2 各組大鼠空間探索試驗結果(±s)

組別 n 原平臺所在象限游泳時間/總時間穿越平臺象限次數正常組 15 0.61±0.09 8.56±1.75假手術組 14 0.58±0.10 8.59±0.89模型組 12 0.33±0.071) 2.42±1.032)與正常組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

3 討 論

AD動物模型大致可分為自然衰老模型、轉基因動物模型和損害模型三大類。每一種模型都部分模擬了AD的癥狀和病理改變。老齡動物的學習記憶存在明顯減退的特點,但AD是在衰老的基礎上發生的病理性神經功能退行性病變,它不同于正常的生理性衰老;大部分的轉基因動物模型都能復制出AD患者的部分神經病理特征但因其制作過程復雜,傳代缺乏穩定性,價格昂貴,難以批量生產等原因,短期內仍難以推廣使用[7,8];Aβ注射模型在病理方面表現出神經纖維纏結(NFT)和神經元缺失,但由于體內存在Aβ自身清除機制而不能得到滿意的效果。IBO損毀Meynert基底核建立的AD模型大鼠能導致動物學習記憶障礙但這種損害是可逆的,并不出現AD患者的典型的組織病理學改變,如 NFT、老年斑(SP)等,具有一定局限性。

Aβ是AD主要病征SP的主要組成成分。Aβ持續損傷大腦神經細胞導致患者進行性智力衰退,進而產生老年斑是AD神經病理過程形成和發展的關鍵[9]。海馬是內側顳葉系統中與學習記憶最密切相關的結構,因此內側顳葉記憶系統又稱“海馬記憶系統”。M RI的資料顯示,AD主要表現為大腦皮質彌漫性萎縮,尤其是兩側海馬的萎縮表現較為突出[10]。故從結構和功能上分析,海馬是AD研究較理想的靶區。

而本實驗將Aβ1-42和IBO混合液共同注入大鼠海馬,破壞與學習記憶有關的膽堿能系統,同時通過凝聚態Aβ1-42使神經元發生退行性變,表現出明顯的學習、記憶獲得、鞏固和再現障礙,且未出現死亡率的升高,相比單因素模型,更接近模擬AD的臨床表現和基本病理特征,是一種可靠的動物模型。

另外,AD患者的臨床表現為智力減退,近期記憶缺失,因此對學習記憶進行評價是觀察老年性癡呆模型及藥物治療效果的重要指標之一[11]。Morris水迷宮一種讓實驗動物學習尋找不透明水中的隱藏平臺的操作過程,是國內外被廣泛采用檢測大鼠空間學習記憶的常用裝置,它是英國心理學家 Richard CM.Morris于1981年首次設計使用的。已經成為一種研究空間學習和記憶的標準模式,廣泛應用于研究海馬和外海馬損傷的效果和藥物的應用[12]。

本實驗水迷宮在此基礎上對過程及細節加以改良:自動尋找設定時間為 120 s比以往60 s更有意義;水溫(22±1)℃,與當時室溫相近,過高溫度大鼠不愛游動,過低溫度大鼠四處游竄;燈管、聲音等會對大鼠游動記憶產生干擾,需要一個穩定的安靜環境。而且結果表明,隨著訓練次數的增加,各組大鼠的逃避潛伏期均在逐漸縮短,但模型組動物逃避潛伏期在第2天～第6天明顯長于正常組和假手術組,并且在空間探索試驗中,模型組大鼠的穿越原平臺次數明顯少于正常組和假手術組,說明模型組大鼠在水迷宮中學習尋找平臺的能力、對平臺在水迷宮的空間位置記憶能力均顯著下降,表明模型大鼠存在學習記憶障礙,從行為學上評價,該模型是相當成功的。

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[2]李亞.β淀粉樣蛋白對衰老模型大鼠學習記憶及大腦皮層內脂褐素含量的影響[J].中國藥理學和毒理學雜志,2001,15(4):311-313.

[3]李亞,王建軍,陳啟盛.β淀粉樣蛋白對衰老模型大鼠腦海馬神經元的毒害作用[J].基礎醫學與臨床,2002,22(6):546-549.

[4]孔明望,王平,田代志,石和元,Aβ-(25～35)合并鵝膏蕈氨酸誘導老年癡呆大鼠模型的建立及評價[J].中國老年學雜志,2008,(10):945-947.

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[12]Zheng Huihu,Xiao Chuanwang,Li Yunli,et al.Correlation of behavior changes and bold signal in Alzheimer-like rat model[J].Acta Biochimicaet Biophysica Sinica,2004,36(12):803-810.