地西泮對5-羥色胺誘導的成年大鼠離體胸主動脈收縮的減弱作用及其機制研究1)

王 微,宋二飛,戚曉靜,張軒萍,張明升

地西泮(diazepam,DZP)是苯二氮艸卓類代表性藥物,臨床上已被普遍應用于鎮靜催眠、抗焦慮、抗驚厥、抗癲癇,其在產科中的應用也已相當廣泛。近年發現,DZP還能有效拮抗中樞神經系統因缺血缺氧和創傷造成的損害。DZP能引起血管平滑肌的松弛[1],較大劑量時可降低血壓,減慢心率。5-羥色胺(5-HT)作用于血管平滑肌,主要經由5-HT2A受體介導而引起多數動靜脈收縮。5-HT除了能直接調節血管張力,還能增高血管平滑肌對去甲腎上腺素(NE)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、組胺等縮血管物質的反應性。當原有動脈粥樣硬化病變或高血壓、糖尿病使血管內皮損傷時,血小板易黏附在血管壁上,促使5-HT釋放增加,加強其縮血管作用,惡化疾病[2]。5-HT受體拮抗劑可治療相應疾病,當DZP發揮其普遍治療作用時,是否會對5-HT引起的血管改變產生相應的影響,對這些疾病的治療有一定的幫助作用?本研究擬通過成年大鼠離體胸主動脈環實驗,觀察不同濃度的DZP對5-HT誘導的血管收縮產生的效應,并探討產生這些效應的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 地西泮由上海旭東制藥有限公司提供(批號071201)。5-HT、乙酰膽堿(Ach)、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAM E)、四乙胺(TEA)、4-氨基吡啶(4-AP)均購自 Sigma公司,氯化鋇(BaCl2)由上海中邦化工廠生產,其余試劑為市售分析純。

1.2 大鼠離體主動脈環標本的制備 SD大鼠,雄性,體重220 g～250 g,由山西醫科大學實驗動物中心提供。將大鼠直接斷頭處死,迅速打開胸腔,分離胸主動脈,將取下的胸主動脈放入4℃的PSS液中,仔細剔除血管周圍的脂肪及結締組織,將動脈剪成3 mm～4 mm的血管環。血管環用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔,橫向懸掛在10 mL浴槽內(浴槽內含有通以100%氧,pH 值為7.4、37℃的PSS液10 mL),下方固定,上方以一細鋼絲連于張力換能器,使用Powerlab生物信號采集與分析系統記錄血管環的張力變化。每個血管環懸掛在浴槽后,調前負荷至2 g,平衡 1 h,其間調整靜息張力,使之維持在 2 g的恒定水平,每15 min換一次營養液。所有血管環用60 mmol/L KCl液刺激3次,待收縮穩定后,開始正式實驗,去內皮的實驗,用與血管內徑相適的棉棒從管腔擦過,連續兩次,用60 mmol/L KCl液刺激,待收縮穩定后加 10-5mol/L的Ach檢驗血管內皮完整性。當Ach不產生舒張作用或舒張幅度小于預收縮的10%時,認為內皮已去除。設定60 mmol/L KCl液引起的最大收縮幅度為100%,以加入不同濃度藥物引起的血管收縮幅度與KCl誘導的最大收縮幅度的比率反映血管張力變化。

1.3 大鼠胸主動脈環收縮作用測定 采用內皮完整的胸主動脈環,加入KCl(60 mmol/L)待血管環收縮達到穩定后用PSS液洗脫,使其恢復到穩定靜息張力,在靜息張力下累積加入5-HT使浴槽中的終濃度依次遞增為10-7mol/L,3×10-7mol/L,10-6mol/L,3×10-6mol/L,10-5mol/L,3×10-5mol/L,觀察血管環的張力變化,制作5-HT的累積濃度-血管反應曲線。

1.4 溶劑組和DZP組對大鼠胸主動脈環收縮作用的影響 采用內皮完整和去內皮的胸主動脈環,加入KCl(60 mmol/L)待血管環收縮達到穩定后用PSS液洗脫,使其恢復到穩定靜息張力,在靜息張力下,溶劑組預孵10-4mol/L溶劑,DZP低濃度組預孵3×10-6mol/L的 DZP,高濃度組預孵 10-4mol/L的DZP,均預孵20 min,再分別加入累積濃度的5-HT,觀察血管環的張力變化。

1.5 DZP減弱5-HT誘導的血管環收縮作用的機制研究 根據濃度-血管反應曲線,計算靜息張力組、溶劑組、DZP低濃度組和高濃度組5-HT對血管收縮作用達50%時所對應的濃度(即EC50值),其接近 3×10-6mol/L。在內皮完整的胸主動脈環上,用KCl(60 mmol/L)誘發血管環收縮達穩定后用 PSS液洗脫,恢復至穩定靜息張力后,對照組預孵低濃度DZP后加入3×10-6mol/L的5-HT,觀察血管環的張力變化。實驗組預孵低濃度DZP后,再分別預孵L-NAME(10-4mol/L),TEA(10-2mol/L),4-AP(10-3mol/L),BaCl2(10-3mol/L),達到穩定收縮坪值后,加入3×10-6mol/L的 5-HT,觀察血管環的張力變化。同法,預孵高濃度DZP,觀察血管環的張力變化。

2 結 果

2.1 DZP對大鼠胸主動脈環張力的影響 在靜息張力狀態下,5-HT對大鼠離體胸主動脈環產生濃度依賴性的收縮作用。與靜息張力狀態下相比,溶劑組 5-HT各濃度收縮作用無明顯差異;DZP低濃度組、高濃度組收縮百分率明顯降低,5-HT濃度為3×10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L,3×10-5mol/L時有統計學意義(P＜0.05),濃度為10-7mol/L,3×10-6mol/L時無統計學意義。詳見圖 1。

圖1 DZP對5-HT誘導的濃度依賴性血管環收縮減弱作用

2.2 內皮對DZP減弱5-HT誘導的血管環收縮作用的影響在去內皮的胸主動脈環上,預孵低濃度DZP,再加入濃度遞增的5-HT,血管環呈濃度依賴性收縮,與內皮完整組相比,其收縮百分率升高,即內皮減弱了DZP對5-HT誘導的血管收縮的減弱作用。在濃度為 3×10-7mol/L,10-6mol/L,3×10-6mol/L,10-5mol/L,3×10-5mol/L時有統計學意義(P＜0.05)。同法,預孵高濃度DZP后,在濃度為 10-6mol/L,3×10-6mol/L,10-5mol/L,3×10-5mol/L時有統計學意義(P＜0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 低濃度DZP對內皮完整和去內皮血管環的影響

圖3 高濃度DZP對內皮完整和去內皮血管環的影響

2.3 L-NAME、TEA 、4-AP、BaCl2對 低濃度DZP減弱5-HT誘導的血管環收縮作用的影響 在內皮完整的胸主動脈環上,對照組血管環出現一個峰值收縮,實驗組預孵阻斷藥L-NAME、T EA、4-AP、BaCl2后減弱了 DZP減弱 5-HT誘導的血管環收縮的作用,表現為收縮峰值的升高(P＜0.05)。詳見圖4。

2.4 L-NAME、TEA、4-AP、BaCl2對高濃度DZP減弱 5-HT 誘導的血管環收縮作用的影響 在內皮完整的胸主動脈環上,對照組血管環幾乎無收縮反應,實驗組預孵阻斷藥L-NAME、BaCl2后減弱了DZP對血管環的收縮抑制作用,出現收縮反應,且有統計學意義(P＜0.05);而實驗組預孵 TEA、4-AP后對血管環作用無統計學意義(P＞0.05)。詳見圖4。

圖4 阻斷劑對低濃度、高濃度DZP減弱血管環收縮作用的影響

3 討 論

地西泮能降低人體動脈血壓[3],在離體胸主動脈環上,能松弛和抑制氯化鉀、氯化鈣、去甲腎上腺素、去氧腎上腺素引起的濃度依賴性的血管收縮,對血管平滑肌具有松弛作用[4,5]。

5-羥色胺為內源性的血管活性因子,是中樞神經系統重要的神經遞質,同時又是重要的血管調節物質。5-HT受體包括七個類型(5-HT1-5-HT7)[6]。目前,已知分布于大血管平滑肌上的5-HT受體主要為5-HT2A亞型,5-HT主要通過血管平滑肌的5-HT2A受體引起血管收縮。受體激動時,經G蛋白的耦聯作用激活磷脂酶C(PLC),PLC促進二磷酸磷脂酰肌醇水解產生三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DG)。IP3最初促使細胞內Ca2+貯存庫釋放Ca2+進入胞漿,隨后由Ca2+的釋放誘發較長的細胞外Ca2+內流。Ca2+與細胞內的鈣調蛋白結合形成復合物,復合物可結合于肌球蛋白輕鏈激酶并使之活化,導致肌球蛋白輕鏈磷酸化和平滑肌收縮;DG在Ca2+存在下可激活蛋白激酶C(PKC),使蛋白質或酶發生磷酸化,從而引起血管收縮[7,8]。本實驗中,DZP使5-HT誘導的血管環的收縮作用減弱,提示DZP可能通過IP3-Ca2+信號通路和DG-PKC信號通路,阻滯內鈣釋放和外鈣內流,減弱了5-HT對血管的收縮效應。

血管平滑肌的舒縮功能可通過內皮釋放的血管活性物質來進行調控,其中一氧化氮(NO)和前列環素(PGI2)是典型的內皮釋放的血管活性物質,能產生強大的舒血管作用[9]。NO能刺激可溶性鳥苷酸環化酶,從而引起血管平滑肌環磷酸鳥苷(cGMP)水平的增加,后者主要通過cGMP依賴性蛋白激酶使鈣內流減少,增加鈣ATP酶對鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管舒張[10]。本實驗中,經DZP預處理,去內皮的血管環引起血管收縮幅度的減弱明顯弱于內皮完整的血管環。在內皮完整的血管環上,L-NAME預處理后,減弱了DZP對血管環收縮作用的減弱,使收縮增強,提示DZP對5-HT誘導的血管環收縮作用的減弱可能與內皮有關,可能有NO途徑的參與。

K+通道活性的改變可使動脈平滑肌細胞膜電位去極化或超極化,是參與動脈血管舒縮調節的重要機制[11,12]。當這些K+通道的活性受抑制時,可使細胞膜去極化,從而使電壓依賴性鈣通道開放,細胞外鈣內流,細胞收縮而導致血管張力增加;相反其被活化時,可使細胞舒張而導致血管張力降低。本實驗分別用TEA、4-AP、BaCl2阻斷鉀通道,低濃度DZP減弱了其對血管環收縮作用的減弱,使收縮增強,提示低濃度DZP對5-HT誘導的血管環收縮作用的減弱可能有KCa、KV、KIR通道的參與。高濃度DZP則只對BaCl2有作用,提示高濃度DZP對5-HT誘導的血管環收縮作用的減弱可能只有KIR通道的參與。

DZP對5-HT誘導的成年大鼠離體胸主動脈環收縮具有減弱作用,其機制可能是通過IP3-Ca2+信號通路、DG-PKC信號通路或通過內皮源性舒血管物質或鉀離子通道使內流入血管平滑肌細胞的Ca2+減少而發揮作用。5-HT對血管、血壓的影響還與5-HT1R有關,DZP對和其相關的疾病及病變是否起到一定的治療作用,還有待進一步研究。

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