淫羊藿苷對人外周血內皮祖細胞NO分泌的影響

申 靜,馬 華,武麗萍,宮建芳,杜海斌

心腦血管病是影響人們健康的重要疾病,動脈粥樣硬化是導致心腦血管病的主要原因,而內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化的始動環節。1997年Asahara等[1]從外周血中分離出一類能分化成為內皮細胞,參與血管形成的單核細胞,并將之命名為內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)。EPCs不僅參與出生后血管形成,而且參與修復損傷血管內皮,在缺血性疾病中扮演著重要的角色[2,3]。隨著對NO和心血管疾病之間關系研究的不斷深入,使人們認識到NO在心血管疾病發生和發展中的中心地位[4],特別是血管內皮細胞產生的NO對維持心血管系統的正常生理功能具有積極的作用。本實驗通過觀察淫羊藿苷對人外周血內皮祖細胞體外分泌NO功能的調控作用,旨在探討淫羊藿可能的內皮保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 外周血取自健康成年志愿者,約40 mL,淫羊藿苷購自中國生物制品(標準品),阿托伐他汀為北京嘉林藥業股份有限公司產品。淋巴細胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司,血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)為英國PeproTech公司產品,M199培養基、胎牛血清為美國Gibco公司產品,乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)和荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)購自美國Sigma公司,CD133和CD34分別為美國Ancell公司和美國BD公司產品,紫外可見分光光度計(UV-9100)為北京瑞利分析儀器公司產品,NO檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 淫羊藿苷溶液的制備 用DMSO溶解淫羊藿甙粉劑,配置成1 μ g/mL原始液,室溫條件下,充分震蕩10 min,超聲溶解1 min,以1 000 r/min,離心20 min后,除去沉淀物,保留上清備用。

1.2.2 細胞培養與鑒定 取健康成年志愿者新鮮外周血40 mL,以密度梯度離心法分離外周血單個核細胞,接種于預先包被有人纖維連接蛋白的培養瓶中,加入含有胎牛血清的M199培養基(10%胎牛血清、VEGF 10 ng/mL,青霉素100 U/mL及鏈霉素100 U/mL),在37℃5%CO2孵箱中靜置培養4 d。4 d后洗掉非貼壁細胞,換培養液繼續培養至7 d。

培養7 d的細胞(以 0.25%胰酶消化,制成細胞懸液)分別與 Dil-acLDL(2.4 μ g/mL)和 FITC-UEA-I(10 μ g/mL)孵育 1 h,2%多聚甲醛固定,通過激光共聚焦顯微鏡鑒定,FITC-UEA-I和DiLDL雙染色陽性細胞則培養細胞為正在分化的EPCs。另以成熟人內皮細胞作對照,采用流式細胞儀檢測細胞表面標志CD34、CD133的表達。

1.2.3 實驗分組 在培養的第7天,洗掉非貼壁細胞,收集貼壁細胞。之后以0.25%胰酶將各孔細胞消化下來制成細胞懸液,以為1×104/cm2的接種密度接種到96孔板,隨機分為對照組(常規培養液)、阿托伐他汀干預組(終濃度10 μ mol/L)、不同濃度的淫羊藿甙干預組(淫羊藿甙濃度分別為10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL的條件培養液)。每組5個復孔。

1.2.4 細胞形態學觀察 普通倒置顯微鏡下觀察不同時期細胞的生長特點及形態。

1.2.5 EPCs NO含量的檢測 將培養7 d的細胞接種于96孔板,24 h后分別給予阿托伐他汀及不同濃度淫羊藿苷干預24 h及48 h,每孔吸取上清 100 μL,按 NO試劑盒說明,取血清樣本,配備所需試劑,按要求操作后在分光光度計550 nm波長處讀取吸光度值,按公式計算血清NO濃度。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.5分析軟件。計量資料用均數±標準差(±s)表示,采用重復測量設計資料方差分析及完全隨機設計資料方差分析,組間資料比較采用ANOVA和 t檢驗。P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 EPCs的鑒定 培養7 d洗去不貼壁細胞及碎片后,可見典型細胞集落:中間為大量的圓形細胞,外周為紡錘形細胞。培養第10天熒光顯微鏡檢顯示:細胞攝取DiI-ac-LDL,顯微鏡下激發紅色熒光,細胞與FITC標記荊豆凝集素I結合,顯微鏡下激發綠色熒光。雙染色陽性細胞呈黃色,為正在分化的EPCs。流式細胞儀示貼壁細胞表達CD 34陽性(38.36±3.70)%,CD133陽性(13.91±1.47)%,進一步證實所培養細胞為EPCs。

2.2 細胞形態觀察 倒置顯微鏡下動態觀察可見:剛剛從外周血分離獲得的單個核細胞呈圓形,體積小;在培養的第2天細胞開始出現成簇現象;第4天細胞開始由圓形轉為梭形貼壁細胞;細胞培養第7天,多數細胞呈梭形或多角形,且有集落樣結構出現。

2.3 淫羊藿苷和阿托伐他汀對EPCs的NO分泌的影響 隨著淫羊藿苷濃度的升高,EPCs培養上清中NO的濃度相應升高,呈一定量效及時效關系。10 ng/mL淫羊藿苷組與對照組差異無統計學意義(P＞0.05),25 ng/mL、50 ng/mL淫羊藿苷組與對照組相比EPCs培養上清中NO濃度明顯提高(P＜0.05或P＜0.01),表明藥物具有提高培養液NO濃度的作用,并且隨者藥物濃度的增加效果逐漸增強。淫羊藿苷各濃度的作用效果均隨著時間的延長而增強。阿托伐他汀組與對照組相比,EPCs培養上清中NO濃度顯著提高(P＜0.01),但不同時間NO的含量差異無統計學意義(P＞0.05),提示阿托伐他汀組作用效果隨著時間的延長沒有增強趨勢。不同濃度淫羊藿苷組與阿托伐他汀組同時間比較,差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。可見,雖然中藥淫羊藿與西藥阿托伐他汀均可促進內皮組細胞分泌NO,但阿托伐他汀作用較為顯著。詳見表1。

表1 淫羊藿苷和阿托伐他汀對EPC的 NO分泌的影響(±s)

表1 淫羊藿苷和阿托伐他汀對EPC的 NO分泌的影響(±s)

組別 劑量 24 h 48 h淫羊藿苷組 10 ng/mL 66.599±4.495 111.695±17.857 25 ng/mL 92.491±12.5971)4)127.950±16.1921)3)50 ng/mL 134.576±10.2752)3)157.746±17.9682)3)對照組 50.068±5.085 60.339±5.130阿托伐他汀組 10 μ mol/L 165.017±14.4852) 169.525±5.9822)與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與阿托伐他汀組同時間比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01

3 討 論

淫羊藿是中國傳統的補益中藥,始載于《神農本草經》,具有補腎陽、強筋骨、祛風濕之功效。現代藥理實驗表明,淫羊藿有效成分為淫羊藿苷,其具有廣泛的生理活性。據文獻報道以淫羊藿苷為主要成分的制劑對心腦血管系統、骨代謝、免疫系統等方面具有廣泛的藥理功效[5]。中醫理論中《素問?逆調論》:“腎者水臟,主津液”,如果腎臟虛損、腎虛精虧一則水不涵木,肝失所養,疏泄失常,膏脂布化障礙;二則腎陽虛失于溫煦,致脾陽不振,脾土運化失調,痰濁內生而發病[6]。腎功能異常,則津液代謝失常,膏脂不運阻于血管則會變生心血管疾病。研究已經表明內皮祖細胞在血管的損失及修復中起著至關重要的作用,他汀類藥是廣泛應用于臨床的一種降脂藥,最近的研究發現其還有很多有益的心血管保護作用,例如增加NO生物利用率、促進內皮祖細胞的動員、穩定動脈粥樣斑塊等[7]。

NO是體內重要的信使分子和效應分子。目前研究認為作為一種新型生物信息分子NO是一種能透過細胞膜擴散的自由基礎。它與某些含氮衍生物一起通過和生物信息分子的相互作用參與機體保護、調節及逆轉等機制,尤其參與調節心血管系統中眾多的生理和病理生理過程。由內皮細胞所生成的NO具有多種生物學效應,NO幾乎參與了人體各個平衡狀態的維持,因此NO生物利用度的降低將直接導致內皮功能的損傷,這可以表現為[8-10]血管內皮依賴性舒張功能的減弱、血小板聚集的增加、白細胞與內皮細胞的黏附、血管平滑肌增生等,目前對于NO的研究中心已經從基礎理論研究逐漸向應用方面過渡[11,12],主要開發NO供體型藥物,己有一些研究成果問世。研究發現一些中藥對促進血管內皮細胞NO合成和釋放具有良好的效果[13]。

本實驗研究證實隨著淫羊藿苷濃度的提高,EPCs培養上清中NO的濃度相應升高,呈明顯的量效關系;且48 h較24 h作用效果明顯增強,呈明顯的時效關系。提示淫羊藿苷可以提高人外周血內皮祖細胞NO的分泌,且呈一定的量效及時效關系,為淫羊藿的血管內皮保護作用、有效防治心腦血管疾病提供了科研依據。本研究表明,淫羊藿具有一定的促進人外周血內皮祖細胞NO分泌的內皮保護作用機制,但淫羊藿防治動脈粥樣硬化,治療心血管疾病的具體機制尚待進一步研究。

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