康腦液對腦缺血再灌注損傷大鼠血清及腦組織勻漿SOD、MDA、NO的影響1)

薛 茜,鄒玉安,韓 敏,張 靜

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病重要的病理生理過程,防治腦缺血再灌注損傷一直是目前缺血性腦卒中治療的熱點,中藥制劑對于腦缺血再灌注損傷后的保護作用受到眾多學者的重視。本實驗應用大鼠復制腦缺血再灌注損傷模型,以益氣活血化瘀、清熱平肝、熄風定驚法立方制成的康腦液進行干預,觀察用藥前后對血清和腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)的含量變化,探討康腦液對腦缺血再灌注損傷的保護作用,為腦卒中的臨床預防和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 雄性標準二級(清潔級)Wistar大鼠30只(購自中國醫學科學院實驗動物中心,體重250 g～350 g)。隨機分成腦缺血再灌注模型組(模型組)、康腦液干預組及假手術組,每組各10只。

1.2 腦缺血再灌注損傷模型的復制 實驗大鼠采用Bannister[1]建立的頸動脈引流法。肌肉注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg全身麻醉,舌靜脈注射0.5%(1 mL/kg)肝素抗凝。分離雙側頸總動脈及右側頸淺靜脈,用動脈夾夾閉左側頸總動脈,同時結扎右側頸總動脈近心端及右側頸淺靜脈遠心端,用自制的插管在右側頸總動脈與右側頸淺靜脈間搭橋,使來自基底動脈的血流經Willis環由右側頸內動脈、頸總動脈逆向引流至頸靜脈造成腦缺血,90 min后開夾并切斷右側頸總動脈引流,使腦血流再灌注。假手術組除不行血管搭橋及頸總動脈夾閉外,余手術過程相同。

1.3 中藥方劑組成、制備及給藥方法 組成:黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七粉等。制備:除三七粉外,常規煎煮兩次,再將兩煎的上清液混合,文火煎濃縮至70 mL,給藥前將三七粉溶于藥液中。給藥方法:每日灌胃給藥1次,連續15 d,每只鼠每次給藥2 mL(給藥量根據公式[2]計算,相當于原生藥3.8 g)。給藥第15 d,給藥后2 h復制腦缺血再灌注模型。模型組及假手術組以等量生理鹽水代替中藥。

1.4 指標測定 動物缺血90 min再灌注180 min后頸總動脈取血清5 mL置于離心管中,4℃冷藏備用。用預冷的生理鹽水制備10%腦組織勻漿,2 500 r/min離心10 min,取上清液-80℃保存備檢。以黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力;以硫代巴比妥酸法(TBA)測定MDA含量;以硝酸還原酶法測定NO活力;以雙縮脲法檢測腦組織蛋白含量。按試劑盒說明嚴格操作。

1.5 試劑和儀器 SOD測定試劑盒(批號 20040812)、MDA測定試劑盒(批號20040828)及NO測定試劑盒(批號20040511)均購自南京建成生物工程研究所。721型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.6 統計學處理 運用SPSS 10.0統計軟件包進行統計分析,實驗數據以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,再用LSD法進行兩兩比較,P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 康腦液對缺血再灌注損傷大鼠血清SOD、MDA、NO的影響(見表1)與假手術組相比,模型組血清中MDA、NO含量明顯增高,SOD含量明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,康腦液干預組血清中MDA、NO含量明顯降低,SOD含量明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 康腦液對缺血再灌注損傷大鼠血清SOD、MDA、NO的影響(±s)

表1 康腦液對缺血再灌注損傷大鼠血清SOD、MDA、NO的影響(±s)

組別 n SOD U/mg MDA mmol/mg NO μ mol/mg假手術組 10 195.99±41.84 3.50±0.51 45.12±8.15模型組 10 125.66±20.791) 5.41±1.541) 83.67±13.671)康腦液干預組 10 182.81±17.622) 3.26±1.263) 55.14±10.603)與假手術組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.2 康腦液對缺血再灌注損傷大鼠腦組織勻漿SOD、MDA、NO的影響(見表2)與假手術組相比,模型組腦組織勻漿中MDA、NO含量明顯增高,SOD含量明顯降低(P＜0.01);與模型組相比,康腦液干預組腦組織勻漿中MDA、NO含量明顯降低,SOD含量明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 康腦液對缺血再灌注損傷大鼠腦組織勻漿SOD、MDA、NO的影響(±s)

表2 康腦液對缺血再灌注損傷大鼠腦組織勻漿SOD、MDA、NO的影響(±s)

組別 n SOD U/mg MDA mmol/mg NO μ mol/mg假手術組 10 38.84±0.85 1.75±0.40 9.30±1.76模型組 10 29.40±3.811) 3.26±0.851) 18.49±4.921)康腦液干預組 10 40.15±3.163) 2.12±0.643) 11.60±1.632)與假手術組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 討 論

腦缺血再灌注損傷可導致嚴重的遲發神經元損傷,影響患者的預后和功能恢復,期間可發生復雜的繼發性改變,加重組織損傷。機體在正常情況下,氧自由基由于機體的代謝損傷而產生并依生理需要及時消除,在腦缺時,自由基清除酶活性降低,自由基產生急劇增多,可廣泛的攻擊富含多不飽和脂肪酸的神經細胞膜和血管,引發脂質過氧化的瀑布效應,最終導致細胞功能紊亂,膜功能喪失,線粒體破壞,神經元壞死。目前多數學者認為自由基引發的脂質過氧化反應主要是在缺血后再灌注的早期[2],細胞膜、細胞器膜的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應,磷脂被降解而變性失能。SOD是主要的抗氧化酶之一,它能夠催化超氧陰離子自由基發生歧化反應,阻斷自由基的毒性反應[3],清除超氧陰離子自由基,保護細胞免受損傷。氧自由基損傷細胞膜結構,生成大量脂質過氧化物,最終產物是 MDA,MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物,間接反映了機體自由基產生的量和體內脂質過氧化反應的程度,MDA的量常可反映機體內脂質過氧化的程度。NO是體內發現的第一個氣體信息分子,在神經系統中發揮著信使分子的重要作用,參與多種生理功能調節,腦內NO在腦缺血再灌注損傷中的作用是雙重性的[4],一方面可以縮小梗死面積,增加皮質供血;另一方面,可與缺血產生的氧自由基協同作用,造成神經細胞損傷。缺血后數小時至數天內產生的NO具有毒性[4],主要機制有:通過氧自由基起細胞毒性作用;NO使各種含鐵-硫的酶失活,阻斷細胞內能量合成及DNA的復制產生細胞毒性作用;NO引起蛋白質的ADP-核糖化,使蛋白質結構和功能改變,并導致迅速的能量耗竭,引起細胞死亡;NO引起多巴胺大量釋放而起神經毒性作用。隨著缺血加劇及再灌注時間的延長,NO的含量明顯增多,加劇缺血再灌注損傷,可見NO水平與腦組織損傷程度相關[5,6]。

康腦液為自擬方,由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七粉等組成,黃芪味甘性微溫,補氣升陽,益衛固表,具有血管擴張、改善血液循環、興奮中樞神經作用;丹參味苦性微寒,活血祛瘀、消腫安神,具有擴張血管、增強血流量的作用;川芎味辛性溫,活血行氣,具有擴張血管、改善機體缺血缺氧狀態之功效;葛根味甘性辛涼,發表解肌、生津止渴,具有止痛、擴張腦血管的作用;鉤藤味甘性微寒,熄風定驚、清肝平肝,具有鎮靜、擴張周圍血管、調節血壓的功效;三七粉味甘性微苦,化瘀止血,消腫定痛,具有增加血流量、調整血壓降低耗氧量、抗血小板聚集之功效。本實驗結果顯示,腦缺血90 min和再灌注180 min后,模型組大鼠血清和腦組織勻漿中MDA、NO含量顯著高于假手術組,SOD含量顯著低于假手術組;給予康腦液干預治療后,能顯著提高大鼠血清和腦組織勻漿中SOD的活性,降低MDA、NO的含量。表明康腦液方藥能較好的提高細胞抗氧化和抑制其脂質過氧化作用,因而對缺血再灌注損傷具有保護作用。

[1]Bannister CM,Sonia A.Ischemia and revascularzation of the middle cerebral territory of the rat brain by manipulation of the blood vessels in the neck[J].Surg Neurol,1984,21:351.

[2]Coert BA,Anderson RE,Meyer FB.A comparative study of the effects of two nitric oxide synthase inhibitors and two nitric oxide donors on temporary focal cerebral ischemia in the wistar rat[J].J Neurosurg,1999,90:332-338.

[3]張敬偉.NO,SOD與缺血性腦血管病的關系[J].中國誤診學雜志,2005,5(5):900.

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[5]孟憲芳,施靜,劉曉春,等.大腦海馬腦片缺血-再灌注模型中一氧化氮及一氧化氮合酶的變化[J].中國腦血管病雜志,2004,1(10):457-460.

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