異丙基腎上腺素充血性心力衰竭大鼠模型心肌細胞凋亡的改變

蔡輝 郭寒 趙智明 董曉蕾 郭郡浩

充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)是各種心血管疾病的共同轉歸，嚴重威脅著人類的健康。大劑量(＞85mg/kg)異丙基腎上腺素(isopreterenol，ISO)皮下注射造成心肌彌漫性壞死和纖維化，并逐漸發展為心力衰竭，心肌病變的發生機制與缺血性心臟病相似，繼發于心臟損害后神經內分泌的激活、血流動力學的改變及心肌重塑等，都能夠很好地反映心力衰竭的自然病理過程。研究發現HF通過對神經內分泌的激活，誘導心肌細胞的凋亡，促進心室重塑的發生［1］，并且心肌細胞凋亡與心肌的病理生理改變和心功能損傷的關系是可逆的［2］。表明心肌細胞凋亡在心力衰竭的發生發展中起了重要的作用［3］。本研究通過皮下注射ISO(170mg/kg)建立Sprague－Dawley(SD)大鼠CHF模型，觀察CHF大鼠心肌細胞凋亡的變化并探討心肌凋亡與CHF的關系。

1 材料與方法

1.1 動物模型復制及分組 9周齡清潔級雄性SD大鼠(體重230～280 g)60只，購于南京中醫藥大學實驗動物中心。ISO購自美國Sigma公司(批號:I5627)。大鼠隨機分為2組:模型組(ISO組)50只，皮下注射ISO(170mg/kg，分2次，間隔24 h);對照組(CON組)10只，皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.25 ml。飼養環境(22.0±2.1)℃，常規飼料喂養，自由飲水。飼養18周，觀察大鼠的飲食、毛色、活動、紫紺、水腫等一般情況，每周稱體重(BW)。于實驗第6周應用彩色超聲監測儀(型號:HP sonos 5500，探頭頻率7.5 MHz，產地:美國)測量左心室舒張末內徑、左心室收縮末內徑、室間隔厚度、左心室后壁厚度、縮短分數、左心室射血分數(LVEF)。測定值為5個心動周期的均值。以LVEF≤45%為造模成功。

1.2 血流動力學檢測 18周實驗結束，將大鼠以戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉后，應用左心導管插入左心室，通過壓力換能器輸入BL－410生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，由實驗系統軟件處理獲得左心室舒張末壓力(LVEDP)、左心室內壓峰值(LVSP)、左心室壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)、心率(HR)。

1.3 臟器質量指數測量 血流動力學檢測完畢后迅速打開胸腔摘取心臟，肉眼觀察后，剪去周圍大血管，在冰0.9%氯化鈉溶液中洗凈血液，濾紙吸干，沿房室交界處去除左右心房，用電子天平(精確度0.0001 g)稱取心室重量(VW)，再剪去右心室游離壁，保留左心室及室間隔，稱取左心室重量(LVW)，分別計算:心室重量指數 VWI(VW/BW)、左心室重量指數 LVWI(LVW/BW)。稱完后在乳頭肌水平下方室間隔及左心室游離壁分別取全層心肌組織4～6塊。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳測定DNA斷片化 將所取心肌組織勻漿，蛋白裂解，進行DNA沉淀溶解后，在含有5μg/ml EB的1%agrose凝膠上電泳1 h后，用UVP成像系統進行拍照。電泳過程中用DNA maker指示DNA片斷。

1.5 免疫印跡分析(western blot analysis) 取冰凍心肌組織融化勻漿，蛋白裂解，離心，取上清液。蛋白定量用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)進行測定，具體定量方法見試劑盒的說明。不同分子量的蛋白樣品經7.5%到15%的SDS－PAGE電泳分離，用半干法轉至PVDF(Millipore，USA)。轉移完后膜用麗春紅S(0.5%ponceaus S in 1%acetic acid)染色，洗滌，與化學發光底物(LumiGLO chemiluminescent substract system，KPL，Guildford，UK)共孵，然后與X線膠片在暗盒曝光5～30 min。沖洗膠片，掃描儀獲取圖象。

1.6 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般性狀 與CON組相比，ISO組大鼠普遍出現:毛色暗黃，納食減少，體重增加，運動緩慢，口、鼻紫紺，有血性分泌物，呼吸有明顯氣喘，足爪水腫，活動減少，抓取反應差。

2.2 血流動力學及臟器質量指數檢測結果 18周血流動力學檢測結果見表。ISO組與 CON組相比大鼠 HR、LVEDP、VWI、LVWI明顯增加(P ＜0.01)，LVSP明顯降低(P ＜0.01)，左心室±dp/dtmax明顯下降(P ＜0.01)。見表1。

2.3 ISO致CHF大鼠心肌DNA斷片化的影響 ISO組心肌組織的DNA梯狀條帶(DNA ladder)的出現。見圖1。

2.4 異丙腎上腺素致CHF大鼠心肌凋亡相關蛋白表達的影響 大鼠心肌相關凋亡蛋白被明顯激活，Bax、活化形式的caspase－9 和活化形式的 caspase－3 的表達均明顯增加，而 Bcl－2的表達則明顯下降。見圖2。

圖1 異丙基腎上腺素誘導CHF大鼠左心室心肌細胞凋亡DNA片移電泳照片

圖2 免疫印跡法檢測異丙腎上腺素誘導CHF大鼠左心室心肌凋亡蛋白 Bcl－2、Bax、Caspase－9 和 caspase－3 的表達

3 討論

ISO致CHF模型具有可控性的特點，通過改變后負荷及心率等，可以復制出不同程度心功能損害的模型，被用來研究慢性心力衰竭不同階段的病理生理和分子生物學特征。與其他模型相比，皮下注射β受體激動藥ISO對大鼠心肌細胞有直接毒性作用，可使其發生壞死和凋亡，從而產生CHF癥狀［4］，更適宜作為探討CHF的發病機制和治療方法的動物模型。

研究表明，多種心臟疾病如慢性缺血性心臟病、慢性超負荷心臟病、心肌炎、心肌梗死導致的心功能不全演變中，心肌細胞、膠原網架和血管床發生了一系列形態結構的改變，即心室重塑，細胞凋亡在心室重塑過程中發揮了關鍵作用［5］。目前認為，從代償性心臟肥大發展至心功能不全，與細胞凋亡有關，發生CHF是心肌細胞進行性喪失的結果，而凋亡也是主要原因之一。實驗證明在各種病理條件下，心肌細胞在分子、細胞水平的一系列變化導致心室重塑，并明確了心肌細胞凋亡成為心室重塑轉向CHF的關鍵因素［6］。

細胞凋亡(apoptosis)又稱程序性細胞死亡(programmedcell death)，是機體維持自身穩定的重要生理機制，它是一種主動、需要能量并受精確調控的生理性死亡，由Kerr等于1972年首先提出這一概念，細胞凋亡的形態學特征表現為核固縮、胞質濃縮、細胞體積變小、細胞骨架解體，其中細胞核變化最為顯著，核及胞漿結構進行性破壞。心肌細胞凋亡受壓力負荷導致的機械壓力、急性心肌缺血、氧自由基、細胞內鈣離子超負荷和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、內皮素(ET)等神經內分泌激素以及細胞因子如TNF、干擾素γ、白介素－1(IL－1)、表皮生長因子、轉化生長因子－β1等眾多因素的影響。Bring早在1994年就指出:在慢性壓力超負荷情況下，凋亡可能作為細胞死亡的一種形式，成為心臟由代償過渡的原因之一;Yu等［7］發現心臟功能降低的自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)和無心功能降低的大鼠相比心肌細胞凋亡明顯增多，證實心肌細胞凋亡可致心功能的改變。而Abbate等［8］進一步發現自發性高血壓的大鼠隨著周齡延長其高血壓進行性增長，出現心肌肥厚及心室重塑，最終導致CHF，在心功能代償向CHF轉變的過程中，心肌細胞凋亡數明顯升高，此結果說明在CHF的動物模型發展過程中，存在心肌細胞凋亡，表明心肌凋亡可能是CHF心功能從代償階段轉入到失代償階段心肌細胞大量減少的重要原因。有資料顯示，自發性高血壓(SHR)靶器官損害與凋亡有關，心肌細胞凋亡是穩定的肥厚心臟轉向CHF的主要原因，表明CHF的發展與細胞凋亡有著密切的關系［9，10］。Khoynezhad 等［11］通過對 CHF 患者進行抗心肌細胞凋亡治療后發現，CHF患者的血流動力學指標明顯改善，并且患者心室重塑情況得到有效控制。

表1 2組大鼠血流動力學和臟器質量指數比較

表1 2組大鼠血流動力學和臟器質量指數比較

注:1mm Hg=0.133 kPa;與CON組比較，*P ＜0.01

組別HR(次/min)LVEDP(mm Hg)LVSP(mm Hg)dp/dtmax(mm Hg/min)－dp/dtmax(mm Hg/min)VWI(mg/g)LVWI(mg/g)CON組(n=10) 400±13 1.2±0.6 120.2±2.3 3.82±0.05 －3.61±0.02 2.52±0.31 2.11±0.23 ISO組(n=50) 453±11* 11.1±0.6* 104.8±1.7* 2.33±0.05* －1.90±0.07* 3.15±0.52* 2.73±0.52*

研究發現心肌細胞凋亡時心肌會發生一系列形態和生化上的改變，Sharov等［12］在對犬CHF模型的研究首先發現了心肌凋亡的證據核DNA碎片;后續研究發現一些可從側面反應了線粒體途徑是心肌細胞凋亡的重要轉導途徑的相關的凋亡蛋白如Bcl－2家族的抑凋亡蛋白Bcl－2和促凋亡蛋白Bax及內源凋亡蛋白 caspase－3/9 等也發生改變［13－17］。

本實驗結果顯示，ISO誘導CHF大鼠2組比較，CHF表現明顯，很好地復制了其臨床表現;并通過超聲觀察發現ISO組與CON組相比，HR、LVEDP明顯增加(P＜0.01);LVSP明顯降低(P ＜0.01)LVEF、明顯降低，心功能降低，LVEDD、LVESD增加，心室腔明顯擴大，IVST、LVPWT減小，心室壁變薄。再通過心臟形態學觀察發現ISO組與CON組相比心肌表現為彌漫性壞死和纖維化，2組相比較ISO組VWI、LVWI顯著增加(P＜0.05)，表現為心臟擴張性的改變;心肌細胞凋亡標志物的檢測發現了典型的DNA梯狀斷片現象，表明心肌DNA斷片比例升高，并且凋亡蛋白 Bax，caspase－9和 caspase－3表達不同程度的升高，而 Bcl－2 表達下降，Bax/Bcl－2 升高，表明促凋亡增加，抑凋亡下降，說明ISO誘導CHF大鼠心肌細胞凋亡增加，與文獻報道一致［1，3］，并且與心室重塑及心功能程度表現一致，由此可以認為心肌細胞凋亡可能是引起CHF及心室重塑的原因。

動物及人體CHF心肌標本均發現細胞凋亡，表明在CHF的進展及心肌重塑方面存在心肌細胞凋亡這一事實，提示阻斷誘導心肌細胞凋亡的信號和(或)阻斷將這些信號與死亡程序連接起來的通道將有助于阻遏凋亡，防止心肌細胞數量的減少，以維持或改善心功能狀態［18］。故在CHF的治療中，抑制心肌細胞凋亡，減少CHF時心肌細胞的缺失，從而減慢其的進展，這將可能是今后一段時間內心力衰竭防治新的治療途徑。

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