一種酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶篩選方法的建立

許多細(xì)菌都能夠合成并釋放一種或多種被稱為自誘導(dǎo)物的信號(hào)分子，胞外的信號(hào)分子濃度能隨細(xì)菌菌體密度的增大而增大，細(xì)菌利用信號(hào)分子在細(xì)胞間的擴(kuò)散，來感知自身和周圍環(huán)境中其它細(xì)菌的數(shù)量變化[1]。當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到一定臨界濃度時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)菌體中相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控菌體的某些生物行為，如生物膜的形成[2]、孢子的生成、熒光的產(chǎn)生、抗生素的生物合成、毒性因子的產(chǎn)生、胞外多糖的合成、細(xì)菌叢集、質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移、穩(wěn)定生長期的進(jìn)入等，以適應(yīng)環(huán)境的變化，這種現(xiàn)象被稱為群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)[3]。

近年來，人們逐漸從一些原核生物以及真核生物中鑒定出了一些酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶，能夠降解細(xì)菌的群體感應(yīng)信號(hào)分子，干擾細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，并且破壞其參與調(diào)控的生物學(xué)功能[4]。更為重要的是，酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶能夠降解特定的決定動(dòng)植物病原菌致病因子產(chǎn)生的群體感應(yīng)信號(hào)分子，減輕或者消除病原菌的致病性。許多能夠合成酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的細(xì)菌(如熒光假單胞菌、蘇云金芽孢桿菌[5]等)或攜帶外源酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因的工程菌與致病菌歐文氏胡蘿卜軟腐病菌混合后接種馬鈴薯，其發(fā)病程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于單獨(dú)接種病原菌[6]。這表明，群體感應(yīng)淬滅機(jī)制很可能會(huì)成為一種新的生防方法。因此，有必要建立一種酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶篩選方法，以滿足科研和生產(chǎn)的需求。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、質(zhì)粒與試劑

紫色色桿菌突變株CV026(Chromobacteriumviolaceum026)報(bào)告菌由上海交通大學(xué)許煜泉教授、華東理工大學(xué)阿華生物工程研究所張?jiān)d教授惠贈(zèng)，LB培養(yǎng)基，Kan抗性，培養(yǎng)溫度為28℃。該報(bào)告菌可以指示3OC6-HSL信號(hào)分子的存在并產(chǎn)生紫色色素。

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司，LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37℃。

信號(hào)分子降解菌aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，其表達(dá)產(chǎn)物AiiA蛋白可以降解3OC6-HSL信號(hào)分子，LB培養(yǎng)基，Kan抗性，培養(yǎng)溫度為37℃。

pLuxRI2質(zhì)粒為美國加州理工學(xué)院Frances H.Arnold教授惠贈(zèng)。

rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA marker，Takara公司；LB培養(yǎng)基，上海捷瑞生物工程有限公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司;其它試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。DNA引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，測(cè)序由上海美季生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1luxI基因的PCR擴(kuò)增

以pLuxRI2質(zhì)粒為模板，根據(jù)3OC6-HSL信號(hào)分子合成酶基因luxI序列設(shè)計(jì)正向引物luxIFP：GTCGGGAATTCCCGAATAAACGCAAGGGAGGTTGG；反向引物luxIRP：AAGTAATCTCGAGGAAGCT-TAACAACATTAATTTAAGACTGC。下劃線部分GAATTC為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)、CTCGAG為XhoⅠ酶切位點(diǎn)。luxI基因PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。luxI基因PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：ddH2O 37.75 μL，10×Buffer(Mg2+)5 μL，dNTP 4 μL，正向引物luxIFP 1 μL，反向引物luxIRP 1 μL，pLuxRI2模板1 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，總體系50 μL。

1.2.2luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)的構(gòu)建

根據(jù)luxI基因及pET-28a(+)質(zhì)粒含有的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，做luxI基因和pET-28a(+)質(zhì)粒的雙酶切。雙酶切反應(yīng)條件：37℃水浴2 h。雙酶切反應(yīng)體系：ddH2O 32 μL，10×Buffer 8 μL，luxI基因或pET-28a(+)質(zhì)粒32 μL，EcoRⅠ 4 μL，XhoⅠ 4 μL，總體系80 μL。將雙酶切后的luxI基因和pET-28a(+)質(zhì)粒按10∶1(用量分別為0.3×10-12mol·L-1和0.03×10-12mol·L-1)的比例連接。連接反應(yīng)條件：16℃連接過夜。連接反應(yīng)體系：ddH2O 12.5 μL，luxI基因6 μL，pET-28a(+)質(zhì)粒3 μL，Buffer 2.5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，總體系25 μL。將連接液轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR鑒定后挑取陽性克隆送樣測(cè)序。

1.2.3 3OC6-HSL信號(hào)分子的合成

將信號(hào)分子合成酶表達(dá)菌luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)的過夜培養(yǎng)物按1%接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，Kan抗性，抗生素工作濃度為50 μg·mL-1，搖床轉(zhuǎn)速為200 r·min-1，37℃培養(yǎng)2～3 h至OD600=0.6，添加終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，28℃培養(yǎng)6 h。取紫色色桿菌突變株CV026過夜培養(yǎng)物與誘導(dǎo)后的luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)各200 μL，混合后置于28℃搖床培養(yǎng)16 h，搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1。觀察終培養(yǎng)物顏色，確定3OC6-HSL信號(hào)分子合成成功。

1.2.4 篩選體系的建立

LB液體培養(yǎng)基，代替實(shí)際篩選體系中用到的信號(hào)分子降解菌aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)的部分。將20 μL LB液體培養(yǎng)基和100 μL產(chǎn)生有3OC6-HSL信號(hào)分子的培養(yǎng)液混合后培養(yǎng)90 min，再與50 μL紫色色桿菌突變株CV026的過夜培養(yǎng)物混合，過夜培養(yǎng)后觀察終培養(yǎng)物顏色。

1.2.5 篩選體系的優(yōu)化

將20 μL LB液體培養(yǎng)基分別和誘導(dǎo)了4 h、6 h、8 h的產(chǎn)生有3OC6-HSL信號(hào)分子的培養(yǎng)液50 μL、100 μL、150 μL、200 μL混合后培養(yǎng)90 min，經(jīng)紫外滅活60 min后，分別與紫色色桿菌突變株CV026的過夜培養(yǎng)物20 μL、40 μL、60 μL混合，過夜培養(yǎng)后觀察終培養(yǎng)物顏色。篩選體系A(chǔ)～L的組成見表1。

表1 篩選體系(A～L)的組成/μL

1.2.6 酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的篩選

利用建立的酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶篩選體系，對(duì)信號(hào)分子降解菌aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)的活性進(jìn)行驗(yàn)證。將信號(hào)分子降解菌aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)的過夜培養(yǎng)物按1%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，Kan抗性，抗生素工作濃度為50 μg·mL-1，搖床轉(zhuǎn)速為200 r·min-1，37℃培養(yǎng)2～3 h至OD600=0.6，添加終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，28℃培養(yǎng)6 h。將20 μL誘導(dǎo)后的aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)分別稀釋1倍、2倍后再與50 μL產(chǎn)生有3OC6-HSL信號(hào)分子的培養(yǎng)液混合后培養(yǎng)90 min，經(jīng)紫外滅活后，與20 μL紫色色桿菌突變株CV026的過夜培養(yǎng)物混合，過夜培養(yǎng)后觀察終培養(yǎng)物顏色。

2 結(jié)果與討論

2.1 luxI基因的PCR擴(kuò)增(圖1)

M.DL2000 DNA Marker 1.luxI的PCR產(chǎn)物

由圖1可以看出，luxI基因的PCR產(chǎn)物條帶單一無拖尾，且小于750 bp，與預(yù)期的621 bp相符，純化后用于質(zhì)粒構(gòu)建。

2.2 luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)的構(gòu)建

對(duì)luxI基因和pET-28a(+)質(zhì)粒進(jìn)行酶切、連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取5個(gè)克隆做菌落PCR鑒定。選擇其中一個(gè)陽性克隆送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果(圖2)和luxI基因的標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致，表明luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)克隆構(gòu)建成功。將序列正確的luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)甘油菌保存于-80℃冰箱中。

圖2 luxI/pET-28a(+)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

2.3 3OC6-HSL信號(hào)分子的合成(圖3)

C.對(duì)照組 T.實(shí)驗(yàn)組

由圖3可以看出，對(duì)照組信號(hào)分子合成酶表達(dá)菌luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，不產(chǎn)生信號(hào)分子合成酶，最終無法合成信號(hào)分子，CV026報(bào)告菌不能產(chǎn)生紫色色素;實(shí)驗(yàn)組luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生信號(hào)分子合成酶LuxI，進(jìn)而合成3OC6-HSL信號(hào)分子，CV026報(bào)告菌在信號(hào)分子的存在下產(chǎn)生紫色色素，即終培養(yǎng)物顯示為紫色，證明3OC6-HSL信號(hào)分子合成成功。

2.4 篩選體系的建立

LB液體培養(yǎng)基和產(chǎn)生有3OC6-HSL信號(hào)分子的培養(yǎng)液混合后培養(yǎng)，由于體系中不含酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶，因此有3OC6-HSL信號(hào)分子存在，與紫色色桿菌突變株CV026的過夜培養(yǎng)物混合后培養(yǎng)，CV026在信號(hào)分子存在的情況下產(chǎn)生紫色色素，即終培養(yǎng)物顯示為紫色(圖4)。若體系中含有酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶存在，則終培養(yǎng)物紫色變淺或消失。由此可以證明該篩選體系建立成功，可以對(duì)酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶進(jìn)行篩選。

圖4 篩選體系的建立

2.5 篩選體系的優(yōu)化(圖5)

A～L 各篩選體系從上至下分別為誘導(dǎo)了4 h、6 h、8 h的luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)信號(hào)分子合成酶表達(dá)菌

由圖5可以看出，箭頭所指的體系為最佳篩選體系，即50 μL誘導(dǎo)了6 h的luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)信號(hào)分子合成酶表達(dá)菌與20 μL不含酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的LB培養(yǎng)基混合后，再與20 μL的CV026報(bào)告菌混合并過夜培養(yǎng)，其終培養(yǎng)物所顯示出的紫色顏色最深。在有酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶存在的情況下，紫色會(huì)變淺或消失。

2.6 酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的篩選(圖6)

1.沒有稀釋的信號(hào)分子降解菌 2.稀釋1倍的信號(hào)分子降解菌 3.稀釋2倍的信號(hào)分子降解菌 C1、C2.不含信號(hào)分子降解菌

由圖6可以看出，加入的信號(hào)分子降解菌的菌量不同，酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的酶量也不同。由于信號(hào)分子被部分或全部降解，CV026報(bào)告菌在少量信號(hào)分子或沒有信號(hào)分子存在下產(chǎn)生很淺的紫色色素或者完全沒有紫色色素產(chǎn)生。由此可見，該篩選體系可以對(duì)酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶進(jìn)行有效的篩選，并對(duì)不同酶活性的酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶具有很好的區(qū)分度。

2.7 討論

(1)信號(hào)分子3OC6-HSL價(jià)格昂貴且易降解。本研究通過構(gòu)建信號(hào)分子合成酶表達(dá)菌luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)合成3OC6-HSL信號(hào)分子，降低了實(shí)驗(yàn)成本，很好地解決了這一難題。

(2)菌種篩選過程工作量大，篩選結(jié)果存在一定的偶然性，方法得當(dāng)可以大大縮短篩選的周期，盡快獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菌種篩選中可以用離心管代替搖瓶，如果有條件保證無菌操作，也可以采用96孔板，既節(jié)省了培養(yǎng)基，又縮短了操作時(shí)間，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。

3 結(jié)論

建立了一種酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶篩選方法，并對(duì)篩選體系進(jìn)行優(yōu)化。最終確定信號(hào)分子合成酶的誘導(dǎo)時(shí)間為6 h、含有信號(hào)分子的培養(yǎng)液的體積為50 μL、CV026報(bào)告菌的過夜培養(yǎng)物的體積為20 μL。該方法可用于酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的篩選，并且對(duì)不同酶活性的酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶具有很好的區(qū)分度。

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