紫花苜蓿高頻組培再生體系影響因素研究

徐春波,王 勇,趙海霞,李興酉

(1.中國農業科學院草原研究所,內蒙古呼和浩特 010010;2.內蒙古農業大學生態環境學院,內蒙古呼和浩特 010018)

紫花苜蓿(Medicago sativa)為多年生豆科植物,是世界上重要的栽培牧草,在我國已有2000年的栽培歷史,其營養價值被列在各種牧草的首位,有“牧草之王”的美譽[1]。

隨著生物技術的發展,利用基因工程培育和改良植物品種成為便捷和實用的手段。轉基因技術通過引入少量有用基因取代了傳統育種中大量基因的介入,減少了無用基因對性狀改良的不良影響,從而可以快速實現育種目標。因此,通過轉基因手段將優良基因轉移到栽培品種中,可以加速培育新品種。而轉基因的前提就是要建立高效組培再生體系。苜蓿組織培養最早見于Saunders等[2]的報道,通過器官形成和體胚愈傷組織發育2條途徑,最終分化成完整的植株,這標志著苜蓿組織培養研究的開始。盡管國內外對苜蓿離體再生體系的研究已經比較深入,但是,再生頻率不穩定、受基因型影響大和再生周期長等問題目前仍有待于進一步研究解決。

1 材料和方法

1.1 供試材料

中苜1號(M.sativa cv.Zhongmu No.1),公農 1號(M.sativa cv.Gongnong No.1),獵人河(M.sativa cv.Hunter Rive)和 WL-323(M.sativa cv.WL-323)苜蓿種子由中國農業科學院草原研究所趙來喜、于林清和王照蘭提供。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗培養 選擇飽滿、種皮完整無破損的優良苜蓿種子,自來水沖洗種子30 min,70%的酒精消毒1 min,無菌水漂洗30 s,然后轉入5%的次氯酸鈉中消毒10 min,再用無菌水沖洗5次。用滅菌濾紙吸干種子表面的液體后接種到無激素的1/2 MS培養基上。

1.2.2 培養基 愈傷誘導培養基:

A.MS+1.0 mg/L 2,4-D

B.MS+1.5 mg/L 2,4-D

C.MS+2.0mg/L 2,4-D+0.25 mg/L KT+2 000 mg/L水解酪蛋白

D.改良SH+4.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA

繼代培養基:

A1.MSO+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA

B1.MSO+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L AgNO3

C1.MSO+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L AgNO3

D1.MSO+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L AgNO3

E1.MSO+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3

分化培養基:

A11.MS

B11.MS+0.5 mg/L KT

C11.MS+1.0 mg/L KT

D11.MS+1.5 mg/L KT

E11.MS+2.0 mg/L KT

生根培養基:1/2MS。

以上培養基中均附加蔗糖20 g/L,瓊脂7.5 g/L,pH5.8,121℃滅菌20 min。培養溫度25℃,光照時間16 h/d,光照強度1 000-2 000 lx。

1.2.3 愈傷組織的誘導 葉片,葉柄和莖段取自2周齡的無菌苗,將莖段和三小葉的總葉柄剪成3～5 mm的小段,將葉片從中脈剪開;子葉和胚軸取自萌發6 d的無菌苗,將下胚軸剪成3 mm長的小段,將子葉從中脈剪開。將外植體分別接種到A,B,C,D 4種培養基上,20 d后統計胚性愈傷率。

1.2.4 愈傷組織的繼代 將愈傷組織轉接到含有不同濃度AgNO3的5種繼代培養基A1,B1,C1,D1,E1上,20 d后統計胚性愈傷率。

1.2.5 愈傷組織的分化 將繼代培養后的愈傷組織轉接到含有不同濃度KT的MS培養基上培養,40 d后統計分化率。

1.2.6 評價指標 胚性愈傷率(%)=胚性愈傷組織數/接種的外植體總數×100%

分化率(%)=分化出苗的愈傷組織數/用于正常分化的愈傷數×100%

2 結果與分析

2.1 培養基對紫花苜蓿愈傷組織誘導及分化的影響

2.1.1 愈傷誘導培養基的選擇 將4個紫花苜蓿品種的葉片分別接種于A,B,C,D愈傷組織誘導培養基上,培養20 d后統計胚性愈傷率(表1)。不同的愈傷誘導培養基對4個紫花苜蓿品種胚性愈傷組織的誘導差異較大,4個紫花苜蓿品種葉片都是在D培養基中的胚性愈傷率最高,其次,是C培養基。因此,選擇D(改良SH+4.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA)培養基作為4個苜蓿品種的最佳愈傷誘導培養基。

表1 不同培養基對胚性愈傷率的影響Table 1 Effect of different medium on embryonic callus induction

2.1.2 繼代培養基的選擇 紫花苜蓿外植體在愈傷組織誘導培養基中形成的胚性愈傷組織較少,形成的愈傷組織大多為白色柔軟的非胚性愈傷組織,這些愈傷組織在分化培養基中很難分化成苗(圖1)。將誘導出來的愈傷組織轉入不同的繼代培養基上,20 d后統計胚性愈傷率(圖2)。可以看出附加不同濃度AgNO3的培養基胚性愈傷率都有所提高,但并不是隨著Ag-NO3濃度的增加胚性愈傷率在逐步上升。在添加1.0 mg/L AgNO3的C1繼代培養基上胚性愈傷率最高達到75%,而且體胚的分化也十分明顯,隨著AgNO3濃度的增加胚性愈傷率反而降低,這可能是Ag+的毒害作用所導致。因此,最佳的繼代培養基為C1(MSO+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L Ag-NO3)培養基。

圖1 2種類型愈傷組織的比較Fig.1 Comparison of two types of callus

2.1.3 分化培養基的選擇 將繼代培養后的愈傷組織轉接到含有不同濃度KT的MS分化培養基中,經40 d的培養,愈傷組織分化出苗,統計分化率。不同分化培養基的愈傷分化率有顯著差異(圖3,4),且隨著KT濃度的增大分化率呈下降趨勢,沒有任何激素的MS培養基上,愈傷分化率達到最高為86.7%,而含有2.0 mg/L KT培養基上的分化率卻只有4.3%,KT沒有起到促進分化的作用,因此本實驗的最佳分化培養基是不加任何激素的MS培養基。

圖2 不同繼代培養基對胚性愈傷率的影響Fig.2 The effecft of differnt subcul ture medium on embryonic callus rates

圖3 不同分化培養基參愈傷組織分化的影響Fig.3 The effect of differentiation medium on callus differentiation

圖4 愈傷組織在不同分化培養基上的分化狀況Fig.4 Callus in different differential medium

2.2 基因型對愈傷組織分化的影響

將4個紫花苜蓿品種相同時期的下胚軸愈傷組織轉接到相同分化培養基上培養,40 d后統計各品種愈傷組織的分化率(圖5)。4個紫花苜蓿品種愈傷組織的分化率差異較大,4個品種愈傷組織分化率為51.7%～76.3%,其中WL-323的愈傷組織分化率最高達到76.3%,為最佳基因型。

圖5 基因型對愈傷組織分化的影響Fig.5 The effect of genotype on callus differentiation

2.3 外植體對愈傷組織分化的影響

將WL-323子葉、葉片、莖段、葉柄和下胚軸5種外植體的愈傷組織分別接種于同一種分化培養基中,40 d后分別統計5種外植體愈傷組織的分化率。5種外植體愈傷組織的分化率差異顯著,愈傷組織分化率從高到低的順序為:下胚軸＞莖段＞葉柄＞子葉＞葉片,下胚軸的愈傷組織分化率最高(圖6),是進行苜蓿組織培養的最佳外植體。

圖6 外植體對愈傷組織分化的影響Fig.6 The effect of explant on callus differentiation

3 討論

3.1 基因型對愈傷組織分化的影響

基因型是影響植物體細胞胚胎發生的關鍵因素,同一物種的不同基因型間體細胞胚發生能力存在很大差異[3]。試驗中植物細胞全能性表達在各植物之間甚至不同屬種之間都有很大的差別,植物的再生性由基因型決定[4,5]。李聰曾對22個國內外不同基因型的紫花苜蓿做了再生試驗,并在國內首次提出了不同基因型對體細胞胚的影響,試驗表明,紫花苜蓿組織培養在分化苗的能力上,不同基因型品種之間存在著很大的差異[6]。通過研究4個不同品種對愈傷分化的影響,結果表明不同基因型的愈傷組織分化率有較大差別,這與前人的研究結果一致,可能是遺傳背景造成的。

3.2 外植體對愈傷組織分化的影響

植株不同器官及部位的生理狀態和功能存在著明顯的差異,不同外植體的選擇必將導致愈傷組織的產生及體細胞胚的形成與發育能力的差異。楊燮榮[7]認為,葉片的分化效果好于葉柄和莖段,其試驗未對子葉和胚軸進行比較。試驗使用苜蓿子葉、葉片、莖段、葉柄和下胚軸5種外植體進行了研究,結果下胚軸的愈傷分化率最高,說明其細胞胚性較強,生長刺激物及生理活性物質含量較高,有利于細胞的分裂和分化,是理想的試驗供體材料。

3.3 AgNO3對胚性愈傷率的影響

植物組織培養是在封閉的容器中進行的,植物細胞會產生乙烯,積累的乙烯可抑制組培植物的生長分化或導致植株的畸形生長和發育[8,9]。Ag+是一種較好的乙烯活性抑制劑,可以競爭性的作用于乙烯作用部位從而促進器官發生和體細胞胚胎的發生。試驗中的繼代培養基上填加適量AgNO3明顯的促進了愈傷質量的改善,胚性愈傷率明顯升高,但Ag+對植物細胞有一定的毒害作用,不宜添加過多。

3.4 KT對愈傷組織分化的影響

自然情況下,一些植物細胞再生較困難是由于內源激素調整緩慢或不完全,外界條件不易控制等因素所致[10],因此,研究者常加一定的外源激素促進細胞再生。在誘導苜蓿愈傷組織和分化再生時,研究結果表明,2,4-D,ZT,KT,BA等植物激素的合理組合都能成功地誘導植株再生[11-18],但是,在本試驗中加有KT反而不能夠促進愈傷組織的分化。KT的作用機制尚不清楚,因此,這一方面還有待于進一步的研究。

[1]黃其滿,俞梅敏.生物技術與苜蓿品質改良[J].高技術通訊,2002(3):101-103.

[2]Saunders J W,Bingham E T.Production of alfalfa plants from tissue culture[J].Crop Science,1972,12:804-808.

[3]Dudits D,Gyorgyey J,Bogre L,etal.Molecular biology of somatic embryogenesis[M].Thorpe TA(ed)In Vitro Embryogenesis in Plants,1995:267-308.

[4]郭光沁,夏光敏,李忠誼.小麥原生質體再生細胞直接形成體細胞胚和再生植株[J].中國科學(B輯),1990,9:970-974.

[5]王海波,李向輝,孫勇如,等.小麥原生質體培養-高頻率的細胞團形成和植株再生[J].中國科學(B輯),1989,8:829-833.

[6]李聰,熊德邵,耿華珠.苜蓿愈傷組織再生植株的研究[J].中國草地,1989(6):51-56.

[7]楊燮榮,邰根福,周榮仁.苜蓿組織培養及植株的再生[J].植物生理學通報,1981(5):33-34.

[8]Roberts D R,Walker M A,Thompson T E,et al.The effects of inhibitors of polyamine and ethylene biosynthesis on senescence,ethylene production and polyamine levels in cut carnation flowers[J].Plant Cell Physicol,1984,25:315.

[9]Robinson K E P,Adams D O,Lee R Y.Differential physiological and morphological response of inbredlinestothylene precursor1-aminocyclopropane-1carboxylic acid by cultured sunflower shoot lips[J].Plant Cell Physicol,1987,6:405.

[10]崔凱榮,戴若蘭.植物體細胞胚胎發生的分子生物學[M].北京:科學出版社,2000.

[11]金淑梅,管清杰,羅秋香,等.苜蓿愈傷組織高頻再生遺傳和轉化體系的建立[J].分子植物育種,2006,4(4):571-578.

[12]劉振虎,盧欣石,葛軍.紫花苜蓿愈傷組織及體細胞胚的細胞學觀察[J].草業科學,2005,22(2):37-40.

[13]王姝杰,閆淑珍,李世訪.紫花苜蓿下胚軸愈傷組織誘導及再生植株的研究[J].植物保護,2005,31(3):50-52.

[14]Barbulova A,Lantcheva A,Zhiponova M,etal.Agrobacterium-mediated transformation for engineering of herbicide-resistance in alfalfa(Medicago sativa L.)[J].Biotechnology and Biotechnological Equipment,2002,16(2):21-27.

[15]Ding Y L,Aldao-Humble G,Ludlow E,et al.Efficient plant regeneration and Agrobacterium-mediated transformationin Medicago and Trifolium species[J].Plant Science,2003,165:1419-1427.

[16]耿小麗,魏臻武,程鵬舞,等.苜蓿花藥培養及倍性鑒定[J].草原與草坪,2008(5):1-5.

[17]柴燕文,馬暉玲,謝小冬,等.應用正交設計優化紫花苜蓿愈傷組織誘導的激素配比[J].草原與草坪,2008(5):40-43,47.

[18]毛雅妮,張德罡,孫娟,等.KT對白花草木樨不同外植體愈傷組織培養的影響[J].草原與草坪,2009(5):33-34,37.