大豆低聚糖粉中棉子糖和水蘇糖的測定方法研究

王玉軍，紀(jì)偉東，李永平

（黑龍江糧食職業(yè)學(xué)院糧油工程系，哈爾濱 150080）

大豆低聚糖(Soybean Oligosaccharides，SBOS)是大豆籽粒中可溶性寡糖的總稱，也可泛指其它豆科作物種子所含有的低聚糖總稱，主要成分是蔗糖（Sucrose）、棉子糖（Raffinose）、水蘇糖（Stachyose）。蔗糖是由α-D-葡萄糖和β-D-果糖以α-1，2糖苷鍵結(jié)合而成。而棉子糖和水蘇糖則是在蔗糖結(jié)構(gòu)中的葡萄糖之C6位以α-1，6糖苷鍵又分別結(jié)合了1分子和6分子的半乳糖，其均屬于非還原性糖。其中棉子糖和水蘇糖為功能性低聚糖，其功能特性主要表現(xiàn)在：促進雙歧桿菌的增值，減少有毒發(fā)酵產(chǎn)物及有害細菌酶的產(chǎn)生，防止腹瀉和便秘，改善血清脂質(zhì)，保護肝功能，降低血壓，增強免疫力，抗腫瘤，合成維生素，防齲齒，低能量或無能量[1]。

大豆低聚糖的測定方法有很多種，其中較準(zhǔn)確的方法是氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)。這兩種方法都具有既可定性又可定量的優(yōu)點。其中HPLC法不但分離效果好，重現(xiàn)性及回收率均比GC法好[2]。利用HPLC測定SBOS方法也有許多報道[3]，如利用carbohydrate色譜柱測定甜菜糖蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉籽糖[3]，及選用Hypersil-NH2色譜柱測定方法[4，5]、μBondapak—C18柱測定方法[6]、反相液相色譜法(RP-HPLC)[7]等方法，本文對采用carbohydrate色譜柱的HPLC方法同時測定大豆低聚糖粉中水蘇糖和棉子糖的方法進行了研究，結(jié)果表明該方法靈敏、準(zhǔn)確、可行。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

試驗儀器：Agilent1100型高效液相色譜儀、示差折光檢測器(G13162A RID)、Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6×150mm,5μm)、SUPELCLEAN ENVI-18化學(xué)工作站。

試驗試劑：水蘇糖、棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司色譜純產(chǎn)品；乙腈為色譜純；大豆低聚糖粉購自陜西森弗生物技術(shù)有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6×150mm,i.d.5μm)；流動相為乙腈-水(75∶25,V∶V)；流速1mL/min；柱溫30℃；RID檢測器，檢測池溫度35℃；進樣量10μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取水蘇糖、棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品（含量均≥98%）各0.02g置于5mL容量瓶中，用去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻。水蘇糖、棉子糖溶液濃度分別為4mg/mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液供HPLC分析用。

1.4 樣品制備

準(zhǔn)確稱取2.00g大豆低聚糖粉，用去離子水溶解并稀釋定容至100mL，混勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液供HPLC分析用。

1.5 測定方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取大豆低聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 5.0μL、10.0μL、15.0μL、20.0μL、25.0μL（相當(dāng)于水蘇糖、棉子糖質(zhì)量20μg、40μg、60μg、80μg、100μg）注入液相色譜儀，進行高效液相色譜分析，測定各組分色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)糖質(zhì)量對相應(yīng)的峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 樣品測定 在相同的色譜分析條件下，取10μL試樣溶液注入高效液相色譜儀分析，測定各組分色譜峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較確定進樣液中水蘇糖、棉子糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

采用示差折光檢測器，采用carbohydrate色譜柱，同時對大豆低聚糖粉中的水蘇糖、棉子糖進行測定，試驗結(jié)果表明，選用carbohydrate色譜柱進行檢測效果較好。

2.2 流動相的選擇

本實驗以乙腈-水為流動相，通過改變乙睛與水的比例優(yōu)化色譜條件。以乙腈-水分別為80∶20、75∶25、70∶30(V∶V)測定了混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和大豆低聚糖中棉子糖、水蘇糖含量和分離情況。實驗表明，隨著乙腈濃度的增加，糖蜜中的糖分離程度提高，當(dāng)流動相中乙腈和水的比例為80∶20時分離效果最佳，但是分離時間較長。當(dāng)流動相中乙腈和水的比例為70∶30時分離效果不好，葡萄糖和相鄰峰的分離度較差。當(dāng)流動相中乙腈和水的比例為75∶25時分離效果很好，且保留時間較理想。綜合考慮各個因素,本實驗采用流動相的比例為75∶25。

2.3 色譜分離

采用上述分析條件，柱溫選定為30℃，棉子糖和水蘇糖分離良好，兩者的保留時間為12.30min、22.90min，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見圖1、圖2。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

以1.5.1中所述方法對混合標(biāo)準(zhǔn)液進行液相色譜分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，標(biāo)準(zhǔn)糖質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，作校正曲線并進行線性回歸。實驗結(jié)果表明：棉子糖和水蘇糖分別在1～10mg/mL、1～10mg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9925、0.9971，以3倍信號比(S/N)為檢出限(LOD)，棉子糖為0.43mg/mL，水蘇糖為0.39mg/mL，回歸方程見圖3、圖4。

2.5 精密度測定

取同一大豆低聚糖粉樣品，按照1.4進行處理，重復(fù)進樣5次，進行精密度實驗，結(jié)果棉子糖和水蘇糖的RSD分別為2.50%和0.16%(見表1)。

表1 檢測方法精密度實驗結(jié)果

2.6 回收率實驗

在濾液中加入一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法處理后進行HPLC分析，棉子糖和水蘇糖的平均回收率為95.8%和96.0%，RSD為1.57%和1.81%，結(jié)果見表2。

2.7 樣品測定

任意選取三份大豆低聚糖粉樣品，按上述方法處理后進行測定分析，測定結(jié)果見表3。

表2 添加回收率實驗結(jié)果（n=5）

表3 大豆低聚糖粉樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

本實驗建立了采用示差折光檢測器(RID)，色譜柱為Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6mm×150mm,5μm)，流動相為乙腈-水(75∶25,V∶V)，流速1.0mL/min，柱溫30℃，同時測定大豆低聚糖粉中棉子糖和水蘇糖含量的高效液相色譜分析方法（HPLC）。實驗結(jié)果表明：棉子糖和水蘇糖分別在1～10mg/mL、1～10mg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9925、0.9971；2種糖的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.57%、1.81%(n=5)，平均回收率分別為95.8%、96.0%。該方法適用于大豆低聚糖粉中棉子糖和水蘇糖含量的檢測。

［1］李本楠，甘卉．大豆低聚糖理化性質(zhì)及其生理功能[J]．中國實用醫(yī)藥，2009，(9)：238-239．

［2］唐春江,鄧放明,王喬隆，等．大豆低聚糖的研究進展[N].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2008，(2):33-37.

［3］董愛軍，張英春，楊鑫，等．高效液相色譜法測定甜菜糖蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉子糖[J]．食品工業(yè)科技，2008，(12)：245-247．

［4］GB/T 22491-2008大豆低聚糖[S]．

［5］馬鶯,駱承祥,吳昊.高效液相色譜法測定大豆乳清中大豆低聚糖[J].分析化學(xué),1999,27(3):367.

［6］張延伸，張東祥，劉國忠，等．高效液相色譜法測定大豆低聚糖[J]．食品工業(yè)，2000，(2)：45-46．

［7］朱建華，楊曉泉．反相液相色譜法同時測定大豆制品中的功能性低聚糖—水蘇糖和棉子糖[J]．糧油加工與食品機械，2005，(11)：75-76．