膠原/PLLA納米粒子復合海綿的制備及其生物相容性評價

盧偉 馮玉杰 巖小麗 樊渝江

支架材料是組織工程的重要因素之一，不僅提供細胞生長的空間結構和幾何形狀，而且影響細胞的黏附、增殖和分化，是組織工程中不可或缺的一環［1-3］。膠原是一類蛋白質材料，不僅可為細胞提供支持保護作用，而且與細胞的粘附、增殖、分化、表型表達均有密切關系，是組織工程中常用的支架材料［4］。但由于膠原本身力學強度較低而常常無法維持需要的形態和結構。將生物降解合成高分子材料(PLLA、PLGA等)與膠原共混制備復合材料是提高其力學性能的常用方法［5］，但疏水性的PLA、PGA和PLGA等與親水性的膠原間缺乏親和力。本文制備了表面親水PLLA納米粒子/膠原復合支架，提高了力學強度，降低降解率，細胞生物學檢測表明其具有良好的細胞相容性。

1 實驗部分

1.1 PLLA納米粒子的制備及表征 將PLLA粉料分散于雙氧水中，紫外光照4 h，水洗、干燥，然后用水分散，與丙烯酸和硫酸亞鐵銨在氮氣保護下反應30 min，經純水和乙醇反復洗滌后干燥。產物用四氫呋喃溶解，去離子水透析，凍干后得到表面改性后PLLA納米粒子。用SEM和DLSP表征其形貌，粒徑和zeta電位。

1.2 膠原/PLLA納米粒子復合支架材料的制備 在膠原醋酸溶液中加入不同量的PLLA納米粒子，使其均勻分散，在20℃凍干，經 100 pa，105℃真空干熱交聯 48 h，50 mmol的EDC和NHS溶液交聯48 h。用SEM觀察其形貌。

1.3 孔隙率和密度 將稱重后(W0)的海綿支架浸泡在乙醇中，減壓處理20 min后，將海綿取出稱質量We。

孔隙率:P=(We-W0)/(Vs)×100%。

密度:D=W0/Vs。

式中，為室溫下乙醇密度(0.789 mg/ml)，Vs由海綿高度和橫截面計算。

1.4 濕態壓縮模量 將支架材料浸泡在PBS中，經真空處理使PBS溶液完全滲透。然后用萬能力學試驗機測量壓縮模量。

1.5 降解率 將支架材料稱重(W0)，分別裝入培養板，加入PBS溶液于37℃靜置。定期取樣凍干稱重(Wd)。降解率 =(W0-Wd)/W0×100%。

1.6 體外細胞播種及檢測 支架滅菌清洗后，用培養基浸泡至溶脹平衡。將L929細胞(1×107/ml)滴加到支架上(100 L/片)，培養4 h使細胞黏附，然后加入1.5 ml新鮮培養基進行培養。在不同時間取樣，用CLSM、SEM觀察細胞在支架材料上的生長情況。用木瓜蛋白酶消化試樣，用H33258染色，測460 nm的吸收值檢測DNA量。

2 結果與討論

2.1 PLLA納米粒子的制備及表征 在雙氧水中紫外福照作用下，PLLA表面形成過氧基團，與二價鐵離子氧化還原體系引發丙烯酸在PLLA表面自由基接枝共聚，形成PLLA-g-PAA接枝共聚物。由于丙烯酸鏈的引入，PLLA表面形成親水鏈段。將接枝共聚物溶于四氫呋喃，在水中透析，可形成能在水中穩定存在的納米粒子。SEM和DLS測試表明，納米粒子為均勻的球形，平均粒徑為316 nm，zeta電位為-39.88 mV，說明其表面由帶負電荷的聚丙烯酸所覆蓋。

2.2 膠原/PLLA納米粒子復合支架材料的制備與表征 表面改性的PLLA納米粒子可與膠原溶液均勻混合，無團聚現象及沉淀的產生。經冷凍干燥和交聯處理，得到多孔膠原/PLLA納米粒子復合支架材料。SEM觀察表明，其平均孔徑約為200 μm，PLLA納米粒子含量增加，其平均孔徑基本無變化。但孔壁厚度和表面粗糙程度增加。對于組織工程支架材料，200 μm的孔徑適合細胞的播種，營養物質和代謝廢物的交換，以及新生組織的形成。孔壁厚度的增加使得支架力學強度提高，而表面粗糙度的增加使細胞貼壁和粘附生長更為容易。

圖1為不同PLLA納米粒子含量的多孔支架材料的空隙率和密度。由圖可見，隨著PLLA納米粒子含量的提高，復合海綿的孔隙率基本無變化，但密度性增加。由于組織工程支架孔隙率的大小直接決定著支架營養物質交換的大小程度，足夠大的支架孔隙率將使得更多的細胞粘附生長。

圖1 不同納米粒子含量的復合支架材料的孔隙率(A)和密度(B)

圖2為不同PLLA納米粒子含量的多孔支架材料的濕態壓縮模量。由圖可見，同純膠原多孔支架相比，PLLA納米粒子的加入大大提高了海綿的濕態模量。隨著PLLA納米粒子量的增加，粒子的物理增強作用，以及其表面上丙烯酸的羧基與膠原氨基反應形成的化學鍵增強，使得海綿壓縮模量從0.78 kpa(Col:NP=6:0) 增加到 1.3，2.5，和3.5 kpa(Col:NP=6:1，6:3和6:6，)。其強度大小可以通過調節PLLA納米粒子含量調節。

圖2 不同納米粒子含量的復合支架材料的濕態壓縮模量

由于PLLA納米粒子表面的羧基與膠原分子氨基反應后，增加了支架材料德交聯程度，多孔支架材料的降解率隨著PLLA納米粒子含量的增加而降低。純膠原多孔支架在14 d后降解達70%以上，而Col:NP=6:6的復合支架材料在14 d后的降解率仍然低于10%，這為細胞生長增殖提供了更持久穩定的空間環境。

3.3 體外細胞播種及培養 膠原/PLLA納米粒子復合支架材料由于PLLA納米粒子的添加，改善了其機械性能，使支架的穩定得以提高，從而有利于細胞的播種和增殖。圖3為細胞播種由24h后的CLSM結果。由圖中可見，隨PLLA納米粒子含量的增加，支架上細胞數量明顯增加，可見細胞成片粘附在海綿孔壁上。這說明支架材料力學性能的提高有利于細胞遷移到支架材料內部，并增加細胞的粘附。支架材料穩定性的增加使營養物質的交換和生理代謝廢物的排出更為容易，對細胞的增殖體現出促進作用。對培養1，3，5 d后不同支架材料中細胞的DNA量進行定量測定，結果表明，隨支架中PLLA納米粒子含量的增加，DNA量從純膠原支架中的0.5 μg增加到Col:NP=6:6的復合支架材料中的2.5 μg，表明在復合支架材料中細胞的數量有非常明顯的提高。

圖3 不同納米粒子含量的復合支架材料播種L929細胞后的CLSM圖像。從左至右:Col:NP=6:0;6:1;6:3;6:6

4 結論

通過自由基接枝聚合，在PLLA表面引入聚丙烯酸，制備了表面包裹可反應性羧基的PLLA納米粒子，并與膠原溶液混合，通過冷凍干燥制備了膠原/PLLA納米粒子復合支架材料，其孔隙率和孔徑與純膠原支架材料相近，而密度、濕態壓縮模量均有明顯提高，降解率降低顯著。這種復合支架材料對細胞的粘附的增殖有良好的促進作用，可望成為一種有用的組織工程支架材料。

［1］曹峻嶺，付強.組織工程化軟骨的構建及應用.西安交通大學學報(醫學版)，2008，29(2):121-126.

［2］Cindy Chung，Jason A.Burdick.Engineering cartilage tissue.Adv Drug Delivery Rev，2008，60:243-262.

［3］鄂征，劉流.醫學組織工程技術與臨床應用.北京出版社，2003.

［4］T.Bhardwaj，R.M.Pilliar，M.D.Grynpas，R.A.Kandel.Effect of material geometry on cartilagenous tissue formation in vitro.J Biomed Mater Res，2001，57:190-199.

［5］G.Chen，T.Ushida，T.Tatsuya，Hybrid Biomaterials for Tissue Engineering:A Preparative Method of PLA or PLGA-Collagen Hybrid Sponge.Adv Mater，2000，12:455.