氨基胍對胰島β細胞保護作用的機理研究

何凌 何美艷 余綺玲 黃春苓 梁偉 王燕 陳定宇

我國最新糖尿病流行病學調查顯示，20歲以上人群糖尿病及糖尿病前期患病率已達到9.7%和15.5%[1]，世界衛生組織預測2025年全球糖尿病患者將達3.8億。糖尿病已成為威脅人類健康的重要公共衛生問題。UKPDS研究發現，在糖尿病確診時，胰島細胞功能僅有正常的50%，隨著疾病進展，β細胞功能進行性衰退[2]，隨之而來的是血糖控制的難度及成本逐漸增加，患者更容易出現各種急、慢性并發癥。然而，目前的治療方案多集中在血糖達標、在胰島功能不斷下降的基礎上使其速度延緩，尚未發現確切治療手段阻止胰島功能進行性衰退。研究表明，氧化應激和非酶糖化在β細胞損傷過程中發揮了重要作用。若能尋找一種治療方式阻止其反應，則為β細胞保護提供了又一可能途徑。氨基胍(Am inoguanidine, AG)是一種親核肼化物，可以有效抑制糖基化終末產物(Advanced Glycation End Products, AGE)及誘導型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Ox ide Synthase，iNOS)產生，已有動物實驗證實氨基胍可預防DR-BB大鼠發生自身免疫性糖尿[3]。本研究嘗試觀察AG對胰島β細胞株NIT細胞的保護作用，為胰島β細胞的保護治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

IL-1β、IFN-γ購自R&D公司，鹽酸氨基胍、DMSO、胰蛋白酶(trypsin)及EDTA購自Sigma公司。低糖型DMEM培養基及胎牛血清購自GIBCO公司；一氧化氮、誘導型一氧化氮合酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 細胞株

胰島β細胞株N IT-1細胞由中南大學代謝內分泌研究所周智廣教授惠贈。

1.1.3 主要儀器

倒置顯微鏡：ZEISS，Ax iover25 CFL，德國；CO2培養箱：Therm o scien tific Form a 371，美國；全波長酶標儀：MULTISKAN SPECTRUM，美國；紫外/可見光分光光度計：AMERSHAM Pharmacia U ltrospec 2001，美國；全自動化學發光免疫分析儀：Bayer CENTAUR，德國。

1.2 方法

1.2.1 NIT-1細胞培養與傳代

N IT-1細胞培養于含10%胎牛血清的DM EM培養基，5%CO2，37℃培養，每日換液1次。待細胞生長至80%融合時，予0.125%胰酶消化細胞，加入含胎牛血清的DMEM終止反應。用滴管輕柔吹打使其成為單細胞懸液，1∶3分瓶傳代。

1.2.2 細胞接種與處理

預實驗選定終濃度：IL-1β50pg/m l，IFN-γ5ng/m l，氨基胍(以下簡稱AG)0.5mm ol/L。處于對數生長期的N IT-1細胞與以下干預因子共培養于48孔板，孵育24h。分為以下4組：①(IL-1β+IFN-γ)組、②(IL-1β+IFN-γ+AG)組、③AG組、④對照組(DM EM)。每組設3個平行孔。(IL-1β+IFN-γ+AG)組為在IL-1β及IFN-γ作用前24h加入AG預先孵育，對照組加入等量DMEM，作用后收集細胞，用于以下實驗。

1.2.3 一氧化氮水平檢測

硝酸還原酶法，取上清液，實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.4 誘導型一氧化氮合酶(iNOS)水平檢測

比色法，取上清液，實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.5 胰島素水平檢測

取上清液，采用化學發光法，由Bayer Cen taur分析儀完成，批內CV3.0%，批間CV 4.1%。

1.3 統計學分析

計量資料用或中位數及范圍表示，計數資料用陽性例數或率表示。正態分布數據2組間均數比較采用t檢驗，2組以上的均數比較用方差分析。非正態分布數據采用非參數檢驗。統計軟件為SPSS11.0，顯著性為0.05。

2 結果

2.1 一氧化氮、iNOS水平檢測

經IL-1β聯合IFN-γ刺激的N IT-1細胞，其分泌NO、iNOS水平較其他各組增高(vs AG組、對照組，P＜0.01；v s IL-1β+IFN-γ+AG組，P＜0.05)，其中AG+IL-1β+IFN-γ聯合處理的N IT-1細胞與IL-1β+IFN-γ破壞組相比，分泌NO，iNOS水平下降(P＜0.05)，與AG組相比，分泌NO、iNOS水平增高(P＜0.05)，見表1。

表1 各組培養上清NO、iNOS、胰島素水平比較

2.2 胰島素水平檢測

NIT-1細胞經IL-1β+IFN-γ破壞，分泌Ins較其他各組減少(P＜0.05)，其中AG+IL-1β+IFN-γ刺激的N IT-1細胞與IL-1β+IFN-γ刺激組相比，分泌Ins增加(P＜0.05)與AG組及對照組無差異，見表1。

3 討論

糖尿病的發生發展涉及到遺傳與環境等多種因素共同作用，目前其病因仍未明確。人們一方面在積極尋找其發病的始動機制，另一方面也在下游觀察一些效應因子的作用，借此篩選出有益于保護胰島β細胞的干預靶點。

近年來，糖基化終末產物在糖尿病進展中的作用已得到證實。AGEs是非酶糖化反應的終末期產物，可沉積于血管壁，通過氧化應激、趨化白細胞、活化蛋白激酶C等發揮作用；AGEs使內皮源性NO生成增加或滅活減少，增加內皮的促凝血活性，引起血流動力學異常。AGEs可直接導致糖尿病微血管病變如糖尿病腎病及視網膜病變。此外，AGEs通過iNOS依賴性NO生成途徑來抑制細胞色素氧化酶C及ATP產生，借此導致胰島素分泌功能受損[4]；AGE尚可沉積于胰島損傷β細胞功能，出現胰島素分泌缺陷及胰島素基因啟動子活性下降[5]。T細胞、巨噬細胞、單核細胞分泌的細胞因子是導致β細胞凋亡的效應因子。而細胞因子誘導的NOS(iNOS)及隨后的NO分泌在β細胞損傷中起到關鍵作用。NOS分為3種：誘導型、內皮型、神經元型。iNOS增加使生成的一氧化氮(NO)和氧自由基(O2-)過量，致胰島細胞內DNA斷裂而破壞其結構與功能，發揮直接毒性效應；另一方面細胞因子可通過誘導β細胞表達Fas受體，與細胞表達的FasL相互作用，使β細胞凋亡[6]。

細胞因子是導致β細胞凋亡的效應因子，iNOS及NO分泌在β細胞損傷中起到關鍵作用。IL-1作用于大鼠胰島細胞明顯抑制胰島素分泌并導致胰島破環，此作用可以被iNOS抑制劑預防。胰島是一個異質群體，除內分泌細胞外，還包含了約0.5%的組織巨噬細胞及其他比例的非內分泌細胞。胰島內巨噬細胞可能是IL-1之來源細胞。活化的巨噬細胞同時分泌iNOS和IL-1才能導致胰島細胞破壞，在僅有NO產生而缺乏IL-1時并不會影響β細胞功能[2]。巨噬細胞在克爾漢大鼠病毒(KRV)誘導BB大鼠發生自身免疫性糖尿病過程中起到關鍵性作用，其效應的發揮主要是通過誘導型一氧化氮合酶(iNOS)及隨之增加的NO。而予氨基胍(AG)處理可以預防糖尿病發生，其作用一方面是眾所周知的抑制iNOS和NO產生，另一方面有助于維持免疫平衡[3]。

本實驗在培養的胰島N IT細胞中加入免疫破壞性細胞因子IL-1β及IFN-γ，導致NIT細胞分泌大量iNOS及NO，胰島素分泌減少。經過AG預處理的N IT細胞，予IL-1β+IFN-γ破壞后，一氧化氮及iNOS分泌減少，其分泌水平與對照組無差異，但仍高于AG單獨作用組；同時，AG+IL-1β+IFN-γ處理組胰島素分泌較IL-1β+IFN-γ組增多，與對照組比較未見差異。提示AG可通過抑制NO及iNOS生成而減輕IL-1β+IFN-γ對N IT細胞的損傷作用，保護N IT細胞的胰島素分泌功能。

氨基胍是一種親核肼化物，可有效抑制細胞內和細胞外組分的非酶糖化及AGE產生。同時氨基胍也是被證實的第一個誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抑制劑，對誘導型的抑制作用較內皮型和神經元型強40～50倍[7]。過繼轉移實驗證實了氨基胍在預防及延緩NOD鼠發生自身免疫性糖尿病中發揮了重要作用[8]。對于糖尿病微血管病變，以氨基胍抑制AGE產生可以防止視網膜毛細血管基底膜變厚、周細胞數目減少及形態異常[9]。氨基胍作為選擇性iNOS抑制劑，可以增加ATP產生及胰島素分泌，延緩小鼠糖尿病發生[4]。那么對于體外培養的胰島細胞，是否具有直接的保護作用呢？李柏峰等[10]發現，iNOS在細胞因子誘導的大鼠胰島細胞凋亡中起到十分關鍵的作用，而氨基胍通過抑制iNOS活性，減輕細胞因子對大鼠胰島細胞的損害，降低了胰島凋亡水平，改善胰島的存活與功能。Koh等[11]發現，氨基胍減少2-脫氧-d-核糖所致胰島H IT-T15細胞內氧自由基及AGEs產生。本實驗也觀察到了氨基胍通過抑制iNOS及NO生成而減輕細胞因子對N IT細胞的損傷作用，保護N IT細胞的胰島素分泌功能。若能從此方面入手，將為胰島功能的保護及糖尿病的預防與治療研究提供更多的選擇手段。

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