CpG ODN誘導人PBMC分泌細胞因子的體外實驗研究

韓 剛,王志剛,賈明庫

(吉林大學第二醫院普通外科,吉林長春130041)

腫瘤的免疫治療是目前腫瘤研究的熱點之一,本文通過應用CpG ODN刺激人PBMC,觀察其對各種細胞因子分泌的影響,分析其在腫瘤免疫治療中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人外周血由長春市中心血站提供;人干擾素-a定量酶聯檢測試劑盒、人干擾素-γ定量酶聯檢測試劑盒、人腫瘤壞死因子-a定量酶聯檢測試劑盒、人白介素-12定量酶聯檢測試劑盒均購自上海生工生物技術服務公司;CpG 2006由上海生工生物技術服務公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人PBMC的分離與培養 每份血樣中加入等量生理鹽水混勻稀釋,離心。分離出離心分層后單個核細胞層,另加RPMI1640后離心,洗滌2次。計算活細胞百分數＞95%。上述的PBMC在無菌條件下、在37℃、5%CO2濃度孵箱內培養。

1.2.2 細胞因子的收集 調整細胞濃度為1×106/mL,加入24孔培養板,每孔1 000 u L。設CpG ODN(CpG2006)組和NoCpG ODN組,每組包括2.5,5,10,15 ug/ml四種濃度,每個樣本設置3個復孔,在24小時測定培養上清液中IFN-α濃度;72小時測定IL-12,IFN-α與TNF-γ的濃度。

1.2.3 細胞因子的檢測 分別建立IFN-α,IFN-γ,TNF-α和IL-12的標準曲線,按試劑盒說明書方法加樣后測吸光值,利用軟件CurveExpert1.34作圖,根據樣品OD值求出相應細胞因子的濃度。

1.3 統計學處理

2 結果

分別采用ELISΑ方法檢測法測定人PBMC釋放的IFN-α,IFN-γ,TNF-α和 IL-12 的濃度,結果表明CpGODN組的3種細胞因子濃度均高于NoCpGODN組,差異有顯著性(P＜0.05)。且其刺激人PBMC釋放4種細胞因子的量與CpG ODN的濃度成正性依賴關系(表1-4)。

表1 CpG2006誘導人PBMC釋放IFN-α的濃度(PG/ml,n=9)

表2 CpG2006誘導人PBMC釋放IFN-γ的濃度(PG/ml,n=9)

表3 CpG2006誘導人PBMC釋放TNF-α的濃度(PG/ml,n=9)

表4 CpG2006誘導人PBMC釋放IL-12的濃度(PG/ml,n=9)

3 討論

CpG ODN具有激活宿主免疫系統的能力,可刺激機體活化對腫瘤的先天免疫并增強抗原遞呈細胞介導的獲得性免疫[1]。本研究發現,B型CpG ODN(CpG2006)能夠有效地刺激人PBMC的增殖,并誘導其釋放抗腫瘤的細胞因子。實驗發現,CpG 2006明顯上調PBMC分泌IFN-α。CpG ODN通過PDC細胞內的信號傳導激活IRF5(interferon regulatory factor 5)發生磷酸化,形成二聚體后進入細胞核,與共同活化因子CBP/P300結合發揮轉錄活性,釋放IFN-α[2];Sugimoto等發現CpG ODN通過TLR9激活下游信號NF-kB,刺激PDC活化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Cot/Tp12)途徑釋放IFN-α[3]。局部產生的IFN-α能刺激NK細胞的分化并增加局部NK細胞殺傷作用。PDC釋放的上述細胞因子可刺激NK細胞與T細胞產生IFN-γ,IFN-γ和IL-12可形成正反饋途徑,在調節Th亞群分化上具有協同作用,促使Thl極性化。這些細胞因子共同發揮免疫調節作用,并以網絡形式啟動抗腫瘤免疫。

研究認為,CpG ODN使PDC成熟并表達高水平的MHC-II,CD40,CD80,CD86,激活 Thl細胞表達CD40L(CD154),CD40L又形成正反饋刺激PDC產生IL-12。IL-12的抗腫瘤作用與促進NK,CTL和巨噬細胞的細胞毒活性有關。IL-12激活的NK細胞可直接引起腫瘤細胞的死亡,并破壞腫瘤血管上皮的完整[3]。

本實驗結果顯示,CpG ODN可以誘導人PBMC釋放I FN-γ。I FN-γ主要由活化的NK細胞和胸腺起源的T細胞產生,IFN-γ在宿主的免疫防御中是一種多效性的細胞因子,PDC釋放的IFN-α。國外的研究發現,用TNF-γ的單克隆抗體處理免疫源性較強的纖維肉瘤的動物模型,其腫瘤的發展較對照組迅速,顯示IFN-γ對腫瘤的抑制作用[4]。在腫瘤的發展過程中,腫瘤細胞可通過多種機制逃避宿主的免疫監視。CpG ODN可以誘導人PBMC釋放多種抗腫瘤作用的細胞因子,可打破腫瘤細胞誘導機體免疫耐受的微環境,有利于機體通過多種方式產生抗腫瘤免疫作用。

因此,本實驗證實,CpG ODN可誘導人PBMC增殖并釋放多種抗腫瘤細胞因子,增加宿主對腫瘤細胞的免疫監視。盡管這樣,以往的調查顯示在具有完整免疫系統的宿主仍會有腫瘤發生。深入研究發現,其腫瘤免疫源性明顯弱于有免疫缺陷宿主發生的腫瘤,這和人類絕大多數的腫瘤缺乏腫瘤特異性抗原相一致。同時也表明在腫瘤的發生過程中,腫瘤細胞缺乏腫瘤特異性抗原是腫瘤細胞對宿主的免疫選擇。因此上調宿主的免疫平衡,打破腫瘤局部免疫環境對腫瘤細胞的耐受將是抗腫瘤免疫研究的焦點。

[1]Weiner GJ,Liu HM,Wooldridge JE,et al.Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94:10833.

[2]Schoenemeyer A,Barnes BJ,Mancl ME,et al.The interferon regulatory factor,IRF5,is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling[J].J Biol Chem,2005,280:17005.

[3]Sugimoto K,Ohata M,Miyoshi J,et al.A serine/threonine kinase,Cot/Tpl2,modulates bacterial DNA-induced IL-12 production and Th cell differentiation[J].J Clin Invest,2004,114:857.

[4]Klinman DM,Yi AK,Beaucage SL,et al.CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6,interleukin 12,and interferon gamma[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93:2879.