Ca2+介導的信號通路對LIMK1的調控研究

王 楊,王 巖,趙建武,高忠禮*

(吉林大學中日聯誼醫院1.骨科;2.臨床基因診療中心,吉林長春130033)

LIM Kinase(LIMK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。人類LIMK家族共發現2個亞系,LIMK1和LIMK2。它們都是由兩個N-末端的LIM結構域、一個間隔區和一個 C-末端的激酶結構域組成[1]。LIMK1穿梭于細胞質與細胞核之間,細胞質中的LIMK1主要是在含肌動蛋白的細胞骨架的組裝中起作用,可直接磷酸化Cofilin蛋白的3絲氨酸殘基使其失活,從而逆轉cofilin誘導的肌動蛋白解聚[2]。Rho等蛋白可通過激活磷酸酶ROCK或是PAK等,進一步使其下游作用子LIMK1活化,從而失活Cofilin[3,4]。有研究證明Rho,Rac通路激活后通過調控靶蛋白Actin重排、誘導腫瘤細胞侵襲及轉移;阻斷Rho,Rac通路,則抑制腫瘤細胞侵襲及轉移[5,6]。本研究著重探討LIM Kinase 1(LIMK1)在Ca2+介導的信號通路中的活性變化及作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人成骨肉瘤MG63細胞為本實驗室保存。重組質粒YFP-SSH1L、HA-LIMK1由王巖教授惠贈。2000(Invitrogen公司)。高糖DMEM培養基(美國Gibico公司),胎牛血清(Hyclone公司),胰蛋白酶和EDTA(Sigma公司)。A23187(Calbiochem)。抗體:P-cofilin,Cofilin(Santa Cruz),HA(3F10;Roche),LIMK1,PLIMK1(Thr508)(Santa Cruz)。免疫共沉淀(Protein G-agarose)試劑盒(邁晨科技有限公司)。

1.2 Western Blot

MG63細胞鋪于35 mM培養皿中,待細胞密度達到60%-70%時,脂質體法轉染HA-LIMK1,48小時后換無血清培養基培養3小時,分別加入濃度為5 μ M 的A23187孵育1,3,5,10分鐘后裂解細胞,離心取上清加入凝膠加樣緩沖液,沸水浴上加熱 5 min,上樣 、電泳、轉膜、雜交(一抗分別 P-LIMK1、HA)、ECL顯色。

1.3 體外激酶測定(In vitro Kinase Assay)

MG63細胞鋪于35 mM培養皿中,待細胞密度達到80-90%時換無血清培養基培養3小時,分別加入濃度為0.5,1,2.5,5 μ M 的 A23187孵育 10分鐘后裂解細胞,根據免疫共沉淀(Protein G-agarose)試劑盒的方法及抗HA抗體,對照組為抗-IgG抗體。回收HA-LIMK1,加入 6.3 μ g/ml cofilin-His6 以及100 μ M ATP 、5 μCi[γ32P]ATP 于 20 μ l激酶反應 buffer中,30℃反應40 min。反應產物進行SDS-PAGE電泳、轉膜,應用放射自顯影技術檢測 32P標記的Cofilin水平。

1.4 免疫熒光染色實驗

MG63細胞在24孔板內鋪片培養,待爬片上的細胞長滿50%-60%時,脂質體法轉染綠色熒光蛋白標記的SSH1L(YFP-SSH1L)質粒。轉染24小時后更換無血清培養基3小時,實驗組加入終濃度為1 μ M的A23187,37℃孵育10分鐘。PBS沖洗3次,4%多聚甲醛室溫固定30 min。加0.1%Triton X-100 30 min,PBS沖洗,血清封閉1 h后加Rhodamine Phalloidin抗體,4℃避光孵育過夜,PBS沖洗,封片,激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus FV500)鏡下觀察。

2 結果

2.1 Ca2+誘導的LIMK1活性的時間依賴關系

我們用5 μ M濃度的A23187分別孵育MG63細胞1,3,5,10分鐘,經Western Blot實驗檢測P-LIMK1(Thr508,代表LIMK1的活性)水平。結果顯示,在誘導初期(1 min)P-LIMK1呈現瞬時增高的趨勢,然后逐漸下降;當誘導10 min時達到最低(圖1)。我們的前期工作結果證明了SSH1L的活性在5 μ M濃度的A23187誘導初期較低,然后逐漸升高;誘導10 min時達到最高[7]。上述結果說明,LIMK1活性變化可能與SSH1L的調控相關。

2.2 Ca2+誘導的LIMK1活性的濃度依賴關系

我們分別用 0.5,1,2.5,5 μ M 等不同濃度A23187孵育MG63細胞10 min,應用體外激酶測定實驗通過32P-cofilin磷酸化水平檢測LIMK1活性,結果顯示當濃度為1 μ M 時P-cofilin水平呈上升趨勢,然后下降,5 μ M時降至最低(圖2),即在較低鈣離子濃度([1 μ M]A23187)的狀態下 LIMK1具有較高的活性,可能與此濃度下SSH1L活性較低,對LIMK1活性調控能力較弱相關連。

2.3 1 μ M的A23187對誘導細胞內Actin骨架蛋白及SSH1L的影響

我們先前的研究已經證實5 μ M 的A23187能夠誘導骨肉瘤細胞偽葉形成,同時Actin骨架蛋白及SSH1L共同移位至膜偽葉(相關論文已投稿)。為了研究1 μ M 的A23187對誘導細胞內Actin骨架蛋白及SSH1L的影響(LIMK1高活性狀態),我們將綠色熒光蛋白標記的SSH1L(YFP-SSH1L)轉染至MG63細胞,經 1 μ M 的A23187孵育后進行了免疫熒光染色。LSCM 下觀察結果顯示,經1 μ M的A23187誘導后,SSH1L與F-actin由細胞內均勻分布變成了不規則共聚集,同時細胞形態也變得不規則(圖3)。

圖1 5μ M A23187對LIMK1活性影響的時間依賴關系

圖2 不同的Ca2+濃度對LIMK1活性的影響

圖3 1μ M的A23187誘導引起細胞內Actin骨架蛋白及SSH1L不規則共聚集

3 討論

細胞骨架蛋白家族成員肌動蛋白(Actin)通過解聚、重聚的動態變化,對維持細胞形態、極性、促進細胞游走、胞質分裂等具有重要作用。參與胚胎發生、器官形成、血管新生、神經構建以及腫瘤轉移、免疫疾患、神經疾患等多種生理及病理過程。近年來的研究結果表明,當腫瘤細胞內某些信號通路激活后,通過誘導靶蛋白Actin的重排,促進腫瘤細胞運動、誘發腫瘤惡化(侵襲、轉移)[8,9]。肌動蛋白解聚因子(cofilin)是肌動蛋白去聚合/切絲因子家族蛋白的一員(Actin Depolymerization Factor),分子量約有21 kD,主要功能是加速actin dynamics,幫助細胞的移動及驅化性[10,11]。Cofilin的功能主要是通過磷酸酶Slingshot(SSH)和LIM 激酶(LIM Kinase/LIMK)雙重調節實現,cofilin能被LIMK介導的磷酸化滅活后又會被SSH重新活化。在Cofilin介導的信號轉導系統中,LIMK及SSH均發揮了重要的作用,他們之間又相互作用、互相制約[12-14]。

在研究Rho家族信號轉導通路時,發現其下游效應子ROCK(Rho associated coiled-coil forming kinase)通過使LIMK1激酶領域的Thr508磷酸化而激活之[15]。同時發現Rho家族之一Rac也通過其下游效應子PAK(p21-activated kinase)使Thr508磷酸化而激活LIMK1[16],LIMK2經由的信號轉導通路與LIMK1相似。SSH均由三種基因編碼,分別為SSH-1,SSH-2,SSH-3,每種都有長型和短型。SSH的N末端有三個高度保守的A,B,P結構域,N末端對于cofilin磷酸化/激活具有重要作用。最新的研究發現,SSH-3L特有的C末端對于SSH的磷酸酶的活性起著負性調控的作用[17]。

LIMK和SSH協同對絲切蛋白調節對細胞定向遷移至關重要,絲切蛋白通過調控遷移細胞前緣肌動蛋白動力學來調節薄片狀偽足的延伸和極化細胞遷移。在活化的Jurkat T細胞中,絲切蛋白活性由LIMK1和SSH21L時空調節。應用RNA干擾(RNAi)抑制LIMK1表達可以抑制趨化因子誘導的薄片狀偽足形成和細胞遷移[18]。LIMK1和SSH-1L之間的反應是由LIMK1的激酶結構域和hSHH-1L的氨基末端結構域共同介導的。A+B結構域和磷酸酶結構域單獨就可以和LIMK1的激酶結構域反應。這種反應很可能是一種直接反應而且并不需要翻譯后修飾。LIMK1和SSH-1L之間的反應會導致LIMK1的去磷酸化,而這種去磷酸化是時間和濃度依賴性的[19]。本研究應用 5 μ M 鈣離子載體A23187誘導細胞,目的在于快速激活細胞內鈣離子介導的細胞內信號轉導通路。Western Blot實驗檢測 P-LIMK1(Thr508,代表LIMK1的活性)水平。結果顯示,在誘導初期(1 min)P-LIMK1呈現瞬時增高的趨勢,然后逐漸下降;當誘導10 min時達到最低。我們的前期工作結果證明了SSH1L的活性在5 μ M 濃度的A23187誘導初期較低,然后逐漸升高;誘導10 min時達到最高。推測LIMK1活性變化可能與SSH1L的調控相關。

我們先前的研究已經證實5 μ M的A23187能夠誘導骨肉瘤細胞偽葉(Lamellipodia)形成,同時Actin骨架蛋白及SSH1L共同移位至膜偽葉(相關論文已投稿)。本研究中我們將綠色熒光蛋白標記的SSH1L(YFP-SSH1L)轉染至MG63細胞,經 1 μ M 的A23187孵育10 min(LIMK1高活性狀態)后進行了免疫熒光染色。LSCM 下觀察結果顯示,經 1 μ M 的A23187誘導后,SSH1L與F-actin由細胞內均勻分布變成了不規則共聚集,同時細胞形態也變得不規則。說明高度激活的LIMK1對SSH1L活性以及SSH1L與F-actin參與的細胞形態的改變具有調控作用。

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