林蛙卵油灌胃對于雄激素預處理大鼠婦科內分泌的影響

苑春莉,孫連坤,康勁松

(1.吉林大學第一醫院 婦產科,吉林 長春130021;2.吉林大學白求恩醫學院病理生理學教研室,吉林 長春130021)

近年來的研究顯示由取蛙油剩余的卵以及由卵提取的卵精油能調節婦科內分泌功能[1-3],本研究旨在通過動物實驗分析林蛙卵油對于紊亂的婦科內分泌系統的調節作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 林蛙卵精油的提取

1.1.1 樣品采集 吉林省樺甸產成齡林蛙,當年初冬捕獲,在剝取林蛙油的同時取林蛙卵巢。

1.1.2 卵油的提取與精制 將林蛙卵巢自然晾干,除去雜質,用乙醇冷浸3次,過濾得卵渣,并減壓回收乙醇,再過濾除去少量沉淀物,又得淺黃棕色液體粗卵油。將卵渣再反復用乙醇浸泡,直至乙醇液基本無色,傾出乙醇,并干燥、粉碎。所得乙醇液仍在減壓下回收乙醇,卵油并入粗卵油中。粗卵油中加入2倍量的乙醇稀釋后,加入20%的中和劑(兼有脫水作用),攪拌均勻,放置1 h后過濾,減壓回收乙醇,即得黃棕色液體精制卵油。

1.2 雄激素處理模型的復制

選擇9日齡Wistar清潔雌性大鼠50只,其中模型組40只,丙酸睪丸酮(25 mg/ml)1.25 mg/只皮下注射,建立丙酸睪丸酮誘導的大鼠模型;正常組10只,同期生理鹽水皮下注射。

1.3 動物實驗

1.3.1 分組 共計50只大鼠,分為5組,分別為高劑量組、中劑量組、低劑量組,模型組和正常組,每組10只,前4組在造模成功后喂養110天至成年。模型組和正常組用生理鹽水3 ml/day灌胃;林蛙卵油各劑量組應用林蛙卵油灌胃,劑量為1.0,0.4,0.1 g/day,用生理鹽水稀釋至3 ml,灌胃15天后處死大鼠。

1.3.2 觀察 在給予灌胃前即開始陰道涂片觀察陰道細胞的變化。處死前稱重,留取動脈血,立即離心留取血清。子宮和卵巢稱重。

1.4 免疫組織化學檢測

雌二醇、FSH、孕酮放免試劑盒購于北京科美東雅生物技術有限公司,嚴格按照試劑盒說明進行實驗。

1.5 統計學方法

采用SPSS11.5軟件進行統計學分析,各組檢測指標用±s表示,以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 陰道脫落細胞改變

模型組陰道細胞涂片見到大量角化細胞,林蛙卵油灌胃后陰道細胞涂片見到有核上皮細胞,尤其在大劑量組見到的有核上皮細胞較多。說明給予林蛙卵油灌胃后大鼠表現出動情前期的變化,卵巢功能有恢復。

2.2 卵巢、子宮的大體觀察

模型組卵巢蒼白,表面可見少量的卵泡,且卵泡較小,亦可見極少量的黃體;子宮較小,色澤欠紅潤。正常組、林蛙卵油大、中、小劑量組大鼠卵巢色澤鮮紅,卵泡數目明顯多于模型組,卵泡明顯增大,表面見較多黃體;子宮外觀粗大發紫,子宮肌層明顯增厚。

2.3 卵巢鏡下觀察

新鮮黃體為體積較大又富有血管的內分泌細胞團,是排卵后,卵泡壁連同血管一起向卵泡腔塌陷,腔內可見凝固的血塊;成熟卵泡即大卵泡,體積較大,凸向卵巢表面,卵泡腔很大,有一明顯卵丘,可見清晰卵細胞;其余為小卵泡。模型組可見大量原始卵泡,卵泡多呈囊性擴張,顆粒細胞層次減少至1-2層,排列松散,卵細胞消失,內含大量漿液性物質,生長卵泡數目較少,極少見黃體出現。而正常組可見各期卵泡及黃體組織,未見囊性卵泡。林蛙卵油大、中、小劑量組生長卵泡數目明顯增多,可見成熟卵泡及黃體,卵泡未見明顯的囊性擴張。

2.4 林蛙卵油對大鼠子宮、卵巢重量及與體重之比的影響

模型組子宮及卵巢重量明顯低于正常組(P＜0.01),而林蛙卵油各劑量均可明顯增加子宮及卵巢的重量(P＜0.001),尤其以林蛙卵油高劑量組增加的最為明顯(見表1)。模型組卵巢體重之比明顯低于正常組(P＜0.05),而林蛙卵油各劑量均可明顯增加卵巢體重之比(P＜0.001),尤其以林蛙卵油高劑量組增加的最為明顯。而林蛙卵油各劑量組對子宮體重之比沒有明顯影響(見表2)。

表1 林蛙卵油對大鼠子宮及卵巢重量的影響

表2 林蛙卵油對大鼠子宮及卵巢與體重之比的影響

2.5 血清學實驗結果

模型組大鼠血清中FSH、雌二醇、孕酮的含量與正常對照組相比明顯降低(P＜0.05),而林蛙卵油各劑量組均能明顯提高大鼠體內FSH、雌二醇的含量,其中林蛙卵油中劑量對體內FSH含量增加最明顯,而林蛙卵油大劑量對體內雌二醇含量增加最為明顯,林蛙卵油各劑量組對體內孕酮含量的改變不明顯(見表3)。

表3 林蛙卵油對大鼠血清中激素水平的影響

3 討論

中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)取蛙油剩余的卵以及由卵提取的卵精油的保健價值很高。彭飛等的研究證實林蛙卵油具有溫和的降低血脂,軟化血管,抑制血小板聚集、改善血液流變學特征、抑制血脂沉積作用[3];又有一定的中樞抑制作用[4,5],林蛙卵油具有明顯的增強機體抗脂質過氧化損傷,調節免疫的抗衰老的生物作用[6],沒有明顯毒副反應,適合患者的用藥心理。

我們的研究發現:模型組陰道細胞涂片見到大量角化細胞,林蛙卵油灌胃后陰道細胞涂片見到有核上皮細胞,尤其在大劑量組見到的有核上皮細胞較多。說明給予林蛙卵油灌胃后大鼠表現出動情前期的變化,卵巢功能有恢復。

處死大鼠后稱量大鼠體重、子宮重量和卵巢重量發現:模型組子宮及卵巢重量明顯低于正常組,而林蛙卵油各劑量均可明顯增加子宮及卵巢的重量,尤其以林蛙卵油高劑量組增加的最為明顯。進一步觀察卵巢、子宮的大體結構改變發現:模型組卵巢蒼白,表面可見少量的卵泡,且卵泡較小,亦可見極少量的黃體;子宮較小,色澤欠紅潤。正常組、林蛙卵油大、中、小劑量組大鼠卵巢色澤鮮紅,卵泡數目明顯多于模型組,卵泡明顯增大,表面見較多黃體;子宮外觀粗大發紫,子宮肌層明顯增厚。結合光學顯微鏡下的觀察,正常組卵巢中可以觀察到新鮮黃體、成熟卵泡(即大卵泡)和小卵泡,未見囊性卵泡。模型組可見大量原始卵泡,卵泡多呈囊性擴張,顆粒細胞層次減少至1-2層,排列松散,卵細胞消失,內含大量漿液性物質,生長卵泡數目較少,極少見黃體出現。林蛙卵油大、中、小劑量組生長卵泡數目較模型組明顯增多,可見成熟卵泡及黃體,卵泡未見明顯的囊性擴張。說明我們制做的雄激素模型可以表現出卵巢中卵泡囊狀擴張、不排卵進而不孕的生物學行為,所以這種模型被作為不孕癥或者多囊卵巢綜合癥的實驗研究模型,在排卵功能上和形態學上代表了兩種疾病的最關鍵的表型,給予初生大鼠大劑量雄激素可以使成年大鼠的卵巢損傷,表現在卵巢萎縮,生長卵泡數量減少和排卵功能的缺失。給予林蛙卵油灌胃后對于這種卵巢損傷有糾正作用,卵巢形態學上恢復正常卵巢的狀態,黃體的出現說明排卵功能的恢復。

我們進一步研究了各組大鼠血清中的雌激素、促卵泡激素和孕酮的含量。發現模型組大鼠血清中FSH、雌二醇、孕酮的含量與正常對照組相比明顯降低,而林蛙卵油各劑量組均能明顯提高大鼠體內FSH、雌二醇的含量,其中林蛙卵油中劑量對體內FSH含量增加最明顯,而林蛙卵油大劑量對體內雌二醇含量增加最為明顯,林蛙卵油各劑量組對體內孕酮含量的改變不明顯。這一結果可以用雌激素在下丘腦-垂體-卵巢軸中的反饋調節作用來解釋:雌激素對于下丘腦分泌的GnRH和垂體分泌的促性腺激素(促卵泡激素FSH和促黃體激素LH)的合成和分泌具有反饋調節作用。小劑量雌激素對下丘腦產生負反饋,抑制GnRH的分泌,減少垂體的促性腺激素的分泌;大劑量雌激素既可以產生正反饋,又可以產生負反饋,排卵前大量產生的雌激素刺激下丘腦GnRH和垂體FSH、LH的大量釋放,而排卵后血清中大量的雌激素與孕激素協同作用,FSH、LH的分泌又受到抑制。我們的實驗結果充分說明,林蛙卵油對于卵巢的保護作用有效的作用成分可能是雌激素:初生期給予雄激素抑制了下丘腦-垂體-卵巢軸的發育,我們測定的多個激素(FSH、E、P)均處于低水平,而給予林蛙卵油灌胃后,補充了外源性雌激素,提高了血清中的雌激素水平,大劑量的雌激素對于下丘腦和垂體產生正反饋作用,刺激FSH水平升高,由于單純的雌激素作用沒有引致大量排卵,缺乏孕激素的協同作用,所以負反饋作用對于FSH分泌的抑制不明顯。至于中劑量組較高劑量組FSH升高明顯的機制,尚待對于林蛙卵油成分的進一步認識。

[1]王 宇,尚德靜,馮伯森.中國林蛙蛙卵營養成分分析[J].遼寧師范大學學報(自然科學版),2004,27(4):471.

[2]杜景新,王 麗,李春慧,等.林蛙油、林蛙卵油的成分及開發利用[J].人參研究,2003,3:18.

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[5]佟 巖,徐 峰,陳 俠,等.中國林蛙卵油的抗焦慮作用[J].沈陽藥科大學學報,2004,21(1):41.

[6]金莉莉,劉德文,范文今,等.中國林蛙卵、卵油及輸卵管對紅細胞SOD活性的影響[J].中國公共衛生,2002,18(5):607.