抗原致敏的臍血樹突狀細胞誘導抗腫瘤效應的體外實驗研究

于 鴻,張 健,劉玉俠,石 虹

(吉林省腫瘤防治研究所,吉林長春130012)

樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)連接先天和適應性免疫。其特點是捕獲抗原和加工,遷移到淋巴器官和表達抗原特異性淋巴細胞活化的各種共刺激分子的能力強[1]。近年來國內外對樹突狀細胞抗腫瘤作用的研究已進入了Ⅰ、Ⅱ臨床實驗階段。我們選用臍血為原料誘導擴增DCs,使其誘導特異性的T細胞殺傷活性,殺傷腫瘤細胞,為DC疫苗臨床應用尋找有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 臍血來源于長春市婦產醫院。NCI446、SMMC-7721、K562細胞株本室常規傳代培養。IL-2購于長春生物制品研究所。MTT,Sigma進口分裝。GM-CSF、IL-4、TNF-α購自 MGI MegaGene。淋巴細胞分離液購自中國醫學科學院血液學研究所。RPMI1640購于Gibico。胎牛血清購自TBD生物技術發展中心。3H-TdR購于中國原子能研究所。植物血凝素(PHA)Sigma。IL-12 ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美。

1.2 腫瘤抗原的制備 取對數生長期的SMMC-7721細胞,0.25%胰蛋白酶消化,調細胞濃度為1×107/ml,42℃水浴熱休克12 h,37℃恢復2 h,超聲破膜,高速離心(15 000 rpm,1 h),收獲上清液,用紫外分光光度計測蛋白濃度,0.22 um濾器除菌,-80℃分裝凍存。

1.3 DCs的誘導 采用本室自制紅細胞裂解液分離臍血有核細胞,獲得的細胞加于淋巴細胞分離液上,2 000 rpm離心20 min。取界面細胞生理鹽水洗2遍,調細胞濃度為1×106/ml,接種于24孔板,每孔1 ml。加入細胞因子GM-CSF100 ng/ml、IL-4 50 ng/ml、TNF-α 10 ng/ml,37℃、5%CO2條件下 培養 2 周 ,每2天加入細胞因子1次。第四天時將細胞分為2組,一組加入抗原50 μ l/孔,另一組作對照。繼續培養至第8天,收上清ELISA法測定IL-12的含量。

1.4 DCs體外刺激T淋巴細胞增殖反應 正常人外周血取自本單位健康志愿者。取抗凝外周血經淋巴細胞分離液梯度離心(2 500 rpm,20 min),取界面細胞用RPMI1640洗滌2遍(1 000 rpm,10 min),制成濃度為3×106/ml的細胞懸液,加入24孔板,1 ml/孔,37℃、5%CO2條件下培養2小時,輕輕洗出懸浮細胞,注入T細胞尼龍毛柱,37℃孵育1小時后,沖洗出非粘附細胞。調T細胞濃度1×106/ml,加入96孔板,100 ul/孔。DC與T細胞的比例分別為1∶50、1∶20、1∶10,37℃、5%CO2條件下培養 96 小時,終止培養前16小時加入3H-TdR(0.5uci/孔)。液閃測量。實驗分組①PHA(2.5 ug/孔)②DC+Ag③DC④T細胞對照。每組4復孔。刺激指數=實驗組cpm/對照組cpm

1.5 DCs活化的T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用

調靶細胞濃度為5×104/ml,加入96孔培養板,每孔100 μ l。按效靶比 50∶1加入 DCs活化的 T細胞,37℃、5%CO2條件下培養72 h,培養結束前4 h加入MTT(5mg/ml)20 μ l/孔 ,繼續培養 4小時,棄上清 ,每孔加入150 μ l DMSO,酶標儀測定波長492 nm處吸光值(A)。實驗分組:①加抗原組②不加抗原組③對照組。每組4復孔。

1.6 結果分析 采用t檢驗。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下觀察,臍血細胞經細胞因子誘導后第3天細胞聚集成均勻散布的細胞聚體,部分細胞變形,胞體拉長,第7天時可見不明顯突起,細胞形態不規則,第14天時可見具有典型樹枝狀突起的樹突狀細胞,呈疏松的貼壁生長或懸浮生長。負載抗原組和未負載抗原組細胞數量和外形上沒有區別。ELISA測定結果表明,抗原負載的DC IL-12分泌量(37.2±8.6 pg/ml)較未負載抗原的DC高(21.7±7.4 pg/ml)。

2.2 DCs對T細胞的激發作用見圖1。在組合細胞因子的作用下,臍血細胞誘生的DCs可刺激T細胞增殖,負載抗原組的DC對T細胞的激發作用較未負載組強。

圖1 DCs對T細胞的激發作用

2.3 DCs活化的T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用見圖2。DCs激活后的T細胞分別與三種靶細胞作用,都產生了明顯的殺傷作用。說明這種非特異性的抗腫瘤活性有趨于廣譜的特點。

圖2 DC激發的臍血有核細胞的體外腫瘤殺傷效應(±s,n=4)

3 討論

抗腫瘤的主要效應細胞是 CD8+T細胞。當DCs遇到促炎性刺激,如細菌產物,就開始了成熟過程,導致炎性細胞因子分泌及MHC分子和共刺激分子表達上調。伴隨著成熟和歸巢到LNs,DCs通過形成免疫突觸與T細胞建立聯系,那里的TCR/MHC相互作用,共刺激分子聚集在圍繞著粘附分子的中心地區。一旦被激活,CD8+CTLs就會擴增數代,并獲得細胞溶解酶的功能。目前DCs疫苗已被看作是一種最有前途的腫瘤疫苗[2]。1986年Srivastava第一次明確提出從腫瘤細胞中提取的HSP-肽復合物具有抑制腫瘤細胞生長的作用,而且這種作用非常特異。隨后Srivastava所做的大量實驗證實HSP-肽復合物的免疫原性來源于腫瘤肽而非HSP本身。HSP可能作為腫瘤肽分子的載體參與MHCⅠ類分子介導的抗原加工途徑,激活CD8+T細胞或是作為γ δ T細胞識別的抗原配體,通過MHCⅡ和非MHC介導途徑,激發CTL介導免疫應答[3]。

本實驗中,我們用自制的紅細胞裂解液分離臍血有核細胞,成本低、操作簡便、污染機會少。經GM-CSF、IL-4、TNF-α聯合培養后,可生成大量的DC。HSP-肽復合物刺激的DC體外可強烈激發T細胞增殖,DC激發的T細胞分別與三種靶細胞作用,都產生了明顯的殺傷作用。DCs在接觸了腫瘤抗原后,其分泌IL-12的能力增強了,IL-12可以增加NK細胞介導的細胞毒性和INF-γ的產生,從而使機體維持一定的針對腫瘤細胞的非特異性免疫應答能力。

以DC為基礎的腫瘤疫苗是目前刺激抗原特異性細胞免疫反應的最有效的方法,臨床實驗表明DC疫苗用于手術或放療、化療后仍有殘存微小病灶的病人,能被很好的耐受,并能在體內介導產生免疫反應。DC疫苗在惡性腫瘤治療中的前景巨大,用于人體安全有效的DC疫苗必將取得更多的突破。

[1]Banchereau J,Pascual V,Palucka AK.Autoimmunity through cytokine-induced dendritic cell activation[J].Immunity,2004,20(5):539.

[2]Triazzi PL,Khurram R,Aldrich WA,et al.Intratumoral injection of dendritic cells derived in vitro in patients with metastatic cancer[J].Cancer,2000,89(12):2646.

[3]孟凡東,楊春明,陳 冬,等.人腎癌組織中熱休克蛋白7O的純化與鑒定分析[J].中國現代醫學雜志,2006,l6(5):672.