山楂中熊果酸和齊墩果酸的高效液相色譜分析

周巧霞， 顧振綸

（1.蘇州九龍醫(yī)院藥劑科，江蘇蘇州 215021;2.蘇州中藥研究所，江蘇 蘇州 215007）

山楂為薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥果實(shí)，具有消食健胃.行氣散瘀作用。用于肉食積滯，胃腕脹滿，瘀血經(jīng)閉，高脂血癥［1］。現(xiàn)代藥理研究表明熊果酸和齊墩果酸是山楂降血脂的主要活性成分，且含量較高［2］。熊果酸和齊墩果酸為一對異構(gòu)體，含量測定多采用高效液相色譜法［3，4］，但在檢測過程中發(fā)現(xiàn)兩組分分離效果不好且拖尾因子過大。本文建立的反相高效液相色譜法很好的解決了這兩點(diǎn)，并對3個批號的樣品進(jìn)行了含量測定，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters510高效液相色譜儀（WDL－95色譜工作站，Waters484紫外檢測器，Waters7725i進(jìn)樣閥）;Sartorius BS110S電子天平（萬分之一）;PHS－3C型精密pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠）。二蒸水;四丁基氫氧化銨、磷酸鹽等均為分析純;甲醇為色譜純。熊果酸和齊墩果酸含量測定用對照品（0742－9909和 110709－200505）購自中國藥品生物制品檢定所;山楂提取物為本所自制。

1.2 樣品制備

對照品溶液:取熊果酸和齊墩果酸對照品約12 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液:取山楂提取物約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.3 色譜條件 分析柱采用μBandapakTMC18柱，300 mm×3.9 mm ID，10 μm粒徑（美國Waters公司）;流動相為pH3.5的甲醇/磷酸鹽緩沖液（85/15含0.4%四丁基氫氧化銨），波長215 nm，流速1.0 mL/min，柱溫:40℃。

2 結(jié)果

2.1 pH的影響 分別配制pH值為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的磷酸鹽緩沖液/甲醇為50/50的流動相，按上述分析方法分離樣品溶液。結(jié)果表明:pH在3.5時熊果酸和齊墩果酸的峰形和分離度較好;pH升高，峰形變窄、保留時間縮短，但熊果酸與齊墩果酸部分重疊;pH降低，峰形變寬、保留時間延長。故選擇pH為3.5左右。

2.2 四丁基氫氧化銨的影響 分別配制含四丁基氫氧化銨為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%（v/v）的流動相，按上述方法分析樣品溶液。結(jié)果表明:四丁基氫氧化銨濃度由0.2%增加到0.4%時，峰形變窄、拖尾因子變小;由0.4%增加到0.6%、0.8%時，峰形和拖尾因子無明顯變化。故選用四丁基氫氧化銨濃度為0.4%。

2.3 甲醇濃度的影響 配制甲醇/磷酸鹽緩沖液不同比例的流動相，按上述方法分析樣品溶液。結(jié)果表明:甲醇比例在85%時，既保持了良好的峰形、分離度和拖尾因子，又有合適的分析時間，故選擇甲醇/磷酸鹽緩沖液為85/15。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μL分別注入高效液相色譜儀測定峰面積，以質(zhì)量對峰面積回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。熊果酸:Y=51 024X+996 0（r=0.999 8），線性范圍為0.82～4.1 μg;齊墩果酸:Y=48 839X+6 932（r=0.999 9），線性范圍為0.80 ～4.0 μg。

2.5 精密度 用以上色譜條件將對照品溶液和樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，熊果酸的RSD為0.57%，齊墩果酸的RSD為0.52%。

2.6 重現(xiàn)性 制備供試品溶液5份，各吸取5 μL進(jìn)樣分析，計算含量。熊果酸的RSD為0.75%，齊墩果酸的RSD為0.68%。

2.7 穩(wěn)定性 取供試品溶液分別于配制后0、1、3、5、21、23、25 h依法測定，熊果酸的RSD為1.45%，齊墩果酸的RSD為1.25%。

2.8 回收率 采用加樣回收（n=5），精密稱取已知含量山楂提取物10 mg，精密加入熊果酸對照品液10 mL和齊墩果酸對照品液3 mL，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按以上色譜條件測定，計算。熊果酸的平均回收率:98.52%，RSD 1.47%;齊墩果酸的平均回收率:98.13%，RSD 1.61%。

2.9 樣品分析 取三批山楂提取物，按供試品溶液制備項(xiàng)下配制，測定含量，結(jié)果見表1、圖1和圖2。

表1 山楂提取物中熊果酸和齊墩果酸含量測定

圖1 對照品HPLC圖譜

圖2 山楂提取物HPLC圖譜

3 討論

拖尾因子是高效液相色譜定量分析時非常重要的一個影響因素，特別是在相鄰兩峰靠得比較近得時候，直接關(guān)系定量的準(zhǔn)確性。本文方法在建立時嘗試了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－磷酸鹽緩沖液、乙腈－磷酸鹽緩沖液等多個流動相，甲醇－磷酸鹽緩沖液體系表現(xiàn)出了較好的分離度和峰形，但拖尾因子仍較大。為了解決這一問題，嘗試了在甲醇－磷酸鹽緩沖液體系中加三乙胺和四丁基氫氧化銨。三乙胺的加入對峰形和拖尾因子沒有明顯影響，但四丁基氫氧化銨加入后，熊果酸和齊墩果酸的峰形明顯變窄、拖尾因子變小。可能的原因是四丁基氫氧化銨加入后與兩種成分結(jié)合生成離子對，改善了在C18色譜柱上的保留。

在反相柱上甲醇的比例增減對熊果酸和齊墩果酸的保留和分離度有影響。選擇的流動相體系既要使兩組分能與眾多雜質(zhì)分離，又要保證有合適的分析時間。

經(jīng)全波長紫外－可見掃描，熊果酸和齊墩果酸的最大吸收波長為207 nm;由于甲醇在此波長處有較強(qiáng)的末端吸收，為了減少干擾又盡量不降低靈敏度，確定在215 nm波長測定熊果酸和齊墩果酸含量。

本法應(yīng)用時，應(yīng)注意pH值的穩(wěn)定，過高或過低都將影響色譜峰的分離度、峰形和拖尾因子，建議將pH值穩(wěn)定在3.5。流動相長時間放置再使用會導(dǎo)致組分保留時間延長，宜現(xiàn)配現(xiàn)用。

經(jīng)不同品牌的C18色譜柱測試，方法的重現(xiàn)性較好。本法曾用于不同產(chǎn)地山楂提取物的含量測定，色譜峰的分離度、峰形和拖尾因子均較好。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:22－22.

［2］陰 健，郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用［M］.北京:學(xué)苑出版社，1993:101－108.

［3］白雪梅，付煜榮，田嘉銘.高效液相色譜法測定大山楂丸和山楂鮮果中齊墩果酸及熊果酸的含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26（8）:981－982.

［4］黃秋妹，李 宗.HPLC法測定山楂中熊果酸和齊墩果酸的含量［J］. 海峽藥學(xué)，2007，19（3）:43－45.