青藤堿對MsPGN大鼠腎臟病理及TNF-a表達的影響

方 敬， 陳志強， 范煥芳， 閆翠環

（河北醫科大學中西醫結合研究所，河北石家莊 050017）

系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）是一種免疫介導的炎癥反應性疾病，是指以腎小球系膜細胞增生和細胞基質積聚為主要病理改變的一類腎小球疾病［1］，近幾年國內有報道，青藤堿可以減輕腎小球炎癥反應的作用，并且副作用小，沒有肝損害。本實驗旨在通過觀察青藤堿對MsPGN大鼠腎臟病理形態學及腫瘤壞死因子－a（TNF－a）表達的影響，探討青藤堿在MsPGN病理過程中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年♂SD大鼠，體重（130±170）g，共40只，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號:冀醫動管字第04057。

1.2 試劑 兔抗大鼠TNF－a多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）;SP（二抗為羊抗兔）試劑盒（北京中山生物技術有限公司）。TNF－a引物上游:5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，下游 5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，（北京賽百盛工程技術服務有限公司）。

1.3 模型制備 動物隨機分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、青藤堿組、雷公藤多苷組，采用改良的慢性血清病性MsPGN模型，10%的水合氯醛麻醉后，經背部切除左側腎臟，在每只大鼠背部皮下分點注射完全弗氏佐劑0.1 mL加BSA 3 mg，于第1、2周末背部皮下注射不完全弗氏佐劑0.1 mL加BSA 3 mg，3周后腹腔注射BSA連續4次，每次間隔 1 h，注射劑量每只分別為0.5、1、1.5、3.0 mg，次日每只腹腔注射BSA 2 mg。第4周正式免疫:尾靜脈與腹腔注射隔日進行，每只大鼠尾靜脈注射BSA劑量從0.5 mg開始，每次增加0.5 mg，至2.5 mg為止，繼續每周加量0.5 mg，至每日用量5 mg為止，腹腔注射量是尾靜脈注射量的1倍，至每日用量10 mg為止，免疫兩周后尾靜脈注射大腸桿菌內毒素（LPS）100 μg/只，全部大鼠于正式免疫8周后處死取腎組織。

1.4 實驗用藥及方法 采用直接灌胃方法，于實驗第4周開始灌胃給藥，每日1次，青藤堿組采用正清風痛寧（白云山正清制藥股份有限公司 批號:9911105），服藥量為30 mg/（kg·d），按成人/（kg·d）劑量的15倍給藥;雷公藤多苷（TWP）組采用雷公藤多苷片（湖南省株洲市制藥三廠 批號:Z43020138）服藥量為20 mg/（kg·d），按成人/（kg·d）劑量的15倍給藥，正常組灌以相應量的自來水。各組灌胃共4周。

1.5 腎組織標本制作及觀察

1.5.1 光鏡 實驗第8周末，無菌下取右腎組織，HE、PAS染色，鏡下觀察并拍片。

1.5.2 免疫組織化學染色 采用SP法觀察腎小球中TNF－a的變化，并進行半定量分析。腎小球內表達:采用HMIAS－2000型高清晰度彩色病理圖象分析系統，每組選取6只大鼠標本，每個標本測量10個完整腎小球進行半定量分析。腎小管的表達:選用標本數及分析系統同上。檢測每張切片10個視野，計算每個視野陽性染色面積以及顯示屏面積，陽性染色面積和顯示屏面積的比值表示相對含量。

1.5.3 逆轉錄－多聚酶鏈反應（RT－PCR） 引物的設計與合成:TNF－α、內參照β－actin的引物設計用PrimerPremier5.0引物設計軟件自行設計完成，由北京賽百盛生物工程公司鑒定并合成。TNF－α的上下游引物序列分別為5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，擴增的基因片段長度為214 bp。混勻，8 000 r/min離心30 s。PCR儀目的基因和內參照同管擴增，反應條件:以95 ℃預變性10 min，95 ℃35 s，54 ℃退火35 s，72 ℃35 s，30循環，72℃延伸10 min。各組 PCR產物20 μl，gold view染色，2%瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠圖像定量分析系統成像，以β－actin為內參照，應用讀膠儀讀取各條產物帶的光密度值，并計算產物的相對表達量。

1.6 統計學處理 使用SPSS11.5 for windows統計軟件，所有數據均用均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析法對實驗結果進行統計學分析。

2 結果

2.1 光鏡觀察結果 正常組腎小球結構正常，腎小球毛細血管腔開放，系膜區的寬度小于血管直徑，腎小管、間質無異常。模型組腎小球系膜區明顯增寬，系膜基質增多，腎小球毛細血管腔受壓變窄或閉塞。部分腎小管上皮細胞腫脹、管腔狹窄，間質有炎細胞浸潤。青藤堿組和雷公藤多苷組腎小球系膜區的寬度明顯小于模型組，其寬度等于或小于毛細血管腔直徑，腎小球毛細血管腔呈開放狀態。

2.2 免疫組化檢驗結果（表1） 正常組腎組織中腎小管僅呈微弱陽性反應，腎小球呈陰性反應;模型組在腎小球及腎小管中分布的范圍和強度明顯擴大和增強;青藤堿組表達明顯降低（與模型組P＜0.01），兩治療組相比無統計學意義（P＞0.05）

表1 免疫組化檢驗結果（±s）

表1 免疫組化檢驗結果（±s）

與模型組比較，##P＜0.01。

組別 樣本數/個 腎小球 腎小管正常對照組模型組青藤堿組雷公藤多苷組6666 1.09±0.27 10.03±2.99 4.52±0.64##4.68±0.55##1.11±0.50 12.11±3.76 5.74±1.38##5.32±1.11##

2.3 RT－PCR結果（表2） 各組腎組織的TNF－αmRNA PCR產物電泳條帶則顯示不均一。正常組有基礎水平的TNF－αmRNA表達。提示MsPGN大鼠TNF－αmRNA表達存在明顯的上調。青藤堿組和雷公藤多苷組TNF－αmRNA表達明顯下調（與模型組P＜0.01），提示青藤堿可以抑制腎組織TNF－αmRNA的表達。兩治療組相比無顯著差異（P＞0.05）

表2 腎組織TNF-αmRNA的表達（±s）

表2 腎組織TNF-αmRNA的表達（±s）

與模型組比較，#P＜0.05 ##P＜0.01。

組別 樣本數/個 TNF－α 0.32±0.02模型組 6 0.81±0.02青藤堿組 6 0.77±0.03#雷公藤多苷組 6 0.76±0.04 mRNA/%正常對照組6##

3 討論

我們選用鄒氏造模法并進行改良制備MsPGN模型［2］，實驗結果表明，青藤堿可以抑制腎小球系膜細胞增殖，系膜基質積聚，延緩病變進展，其作用機制可能與該藥抑制TNF－a的表達有關。

TNF－a可以通過多種途徑作用于系膜細胞。首先TNF－a促進系膜細胞主要組織相容性抗原Ⅰ和Ⅱ表達，促進5’－核苷酸、促凝血物質，糖蛋白合成;TNF－a與IL－1協同作用在轉錄和翻譯水平刺激系膜細胞合成前列腺素和花生四烯酸，增強磷脂酶A活性，增強環氧化酶活性，使MC增殖、基質增寬［3］;而且 TNF－a誘導系膜細胞產生血小板活化因子（PAF）［4］，影響腎臟血液循環的同時，也可改變腎小球系膜細胞的功能，使其發生細胞收縮，導致細胞形態和細胞骨架改變，刺激系膜細胞分裂增殖。此外，TNF－a本身的毒性作用可以造成系膜細胞變性及壞死性改變。

綜上所述，青藤堿通過下調TNF－a及TNF－amRNA的表達，從多種途徑作用于系膜細胞，改善MsPGN大鼠腎臟病理改變，延緩腎小球硬化。

［1］Nagler Aron，Helena Aingon A.Inhibion of glomerular mesangial cell proliferation and extracellular matrix deposition by halafuginone［J］.Kindey Int，1997，52:1561.

［2］賈 慧，鄒萬忠.改良慢性血清病性大鼠系膜增生性腎炎模型的建立［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，1996，5（3）:21－25.

［3］Watanabe K，Nakagawa H.Cytokines enhance the production of a chemotactic factor for polymorphonuclear leukocytes by rat venal glomerular epit helioid cells［J］.Nephron，1990，54:169.

［4］Camussi G，Turello E，Tetta C，et al.Tumor necrosis factor induces contraction of mesangial cells and alters their cytoskeletons［J］.Kidney Int，1990，38（5）:795－802.