應用高速逆流一次性分離川芎中的蛇床內酯A和Z-蒿本內酯

劉 雯， 吳平麗， 卓 超， 張繼全， 沈平孃*

（1.華東理工大學藥學院，上海 200237;2.國家中藥制藥工程技術研究中心，上海 201203）

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的根莖，始載于《神農本草經》。其性溫，味辛，微苦，具有活血行氣、祛風止痛功效。主治血瘀氣滯所致月經不調，痛經經閉，肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛、風寒濕痹、跌打腫痛等。

川芎揮發油含有多種苯酞化合物，其中Z－蒿本內酯（Z－Ligustilide）含量最高，超過 1.0%［1］，其次為蛇床內酯A（Senkyunolide A）。據報道，蒿本內酯與蛇床內酯可以抑制血小板凝聚，松弛子宮、氣管與血管平滑肌，可用于治療咳嗽、月經不調和高血壓等［2－3］。

圖1 蛇床內酯A和Z-蒿本內酯的結構Fig.1 The construction of senkyunolide A and Z-ligustilide

蒿本內酯與蛇床內酯結構均極不穩定，短時間內即可轉換結構［4］。傳統的分離方法不適于蒿本內酯的分離，雖然也有文獻報道用半制備高效液相色譜法、毛細管電泳分離蒿本內酯，但難以避免固相對分離物的吸附。

高 速 逆 流 色 譜 （High－Speed Counter－Current Chromatography，HSCCC）是近幾十年來發展起來的液－液色譜分離技術。此項技術不需要固相載體，只需要被分離物在兩相中分配，避免了固相載體帶來的大量樣品吸附、損失與污染等問題，樣品回收率高，預處理及后處理都簡便易行，已廣泛應用于分離［5－6］。

本研究應用HSCCC一次性分離了Z－蒿本內酯和蛇床內酯A，取得了良好的分離效果。

1 儀器與試劑

TBE－300A型高速逆流色譜儀（上海同田生化有限公司），?KTA purifier P－900 泵，UV－900 紫外檢測器（GE Healthcare美國），HX－1050恒溫循環器（北京博醫康），Agilent 1100高效液相色譜系統（Agilent美國）DAD檢測器，實驗室超級純水器（上海賽鴿電子科技有限公司）。

正己烷、乙酸乙酯、乙醇均為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。川芎藥材由上海康橋飲片有限公司提供。

2 分離試驗用粗提物的制備

稱取川芎生藥材100 g，粉碎成細粉，加入600 mL乙醇，加熱回流提取，提取3次，每次2 h，過濾，減壓蒸干，得39 g棕黃色浸膏備用。

3 溶劑體系分配系數的測定

在溶劑系統的選擇中，樣品組分的分配系數的測定是相當重要的準備工作，分配系數是樣品組分在溶劑系統上下相中樣品組分在溶劑系統中的分配系數K接近于1（即0.2—3），即分配系數在此范圍內時即可用來分離目標產物，溶劑系統適合分離目標成分。

根據文獻［7］報道，選擇正己烷－乙酸乙酯－乙醇－水溶劑系統為基礎，進行分配系數的篩選研究。

稱取浸膏1.0 g左右，共稱取6份，放入20 mL的具塞試管中，按照表1中的溶劑體系，各配制10 mL，分層后，上下層各取2 mL加入到上面的試管中［8］，給予充分的振蕩，搖勻后，再靜置分層，將各個溶劑體系的上下相分別蒸干，使用甲醇溶液定容到1 mL的量瓶中，經過針式濾器過濾后，用高效液相色譜計算分配系數。

4 高速逆流色譜分離試驗過程

根據分配系數測定的結果，兩相溶劑系統采用正己烷－乙酸乙酯－乙醇－水（1∶1∶1∶1），臨用前分開上下相，超聲30min。以溶劑系統的上相為固定相，下相為流動相，以9 mL/min的流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個管路后，停泵，啟動主機，把轉速調至892RPM，然后以1.2 mL/min的流速泵入流動相。當上下相平衡時，記錄固定相流出的體積，計算得到固定相保留值0.53。供試品100 mg溶解于50 mL流動相，濃度為10 mg/mL，進樣量為10 mL，以1.2 mL/min的流速泵入流動相。紫外檢測波長為280 nm，根據紫外檢測譜圖，收集各峰的組分，將各峰對應的收集液分別濃縮，干燥。用HPLC及TLC檢測。

5 結果

5.1 分配系數測定結果

采用文獻報道的HPLC［14］測定方法分析，溶劑體系的分配系數計算結果如表1。根據溶劑系統的選擇原則，選取3、5和6號體系進行分離試驗考察，結果表明，3號體系可以達到最佳分離效果。

表1 樣品組分在各溶劑體系中分配系數測定結果Table 1 The K-value of different solvent system

5.2 分離結果

川芎粗品的HSCCC見圖2。進樣60 min后開始出峰，7 h內出5個峰，分別對應收集流出液。根據已有文獻的液相條件來初步確定成分，峰4為蛇床內酯A，峰5為Z－蒿本內酯。

圖2 川芎高速逆流色譜技術分離結果Fig.2 The HSCCC result of the separation of Ligusticum chuanxiong Hort

5.3 結構鑒定

5.3.1 核磁共振（NMR）對HSCCC分離峰的結構分析

Z－蒿本內酯:1H－NMR（500 MHz，CDCl3，TMS）δppm:6.24（1 H，d，J=9.7，H－7），5.95（1 H，dt，J=9.5，4.4，H－6），5.20（1 H，t，J=7.6，H－8），2.60（2 H，m，H－4），2.42（2 H，m，H－5），2.38（2 H，m，H－9），1.48（2 H，tq，J=7.4，7.8 H－10），0.92（3 H，t，J=7.4，H－11）。以上數據與關于蒿本內酯的文獻［9－10］一致。

蛇床內酯 A:1HNMR（CDCl3）:1H－NMR（500 MHz，CDCl3，TMS）δppm:6.18（1 H，dt，J=9.6，2.0，H－7），5.92（1 H，dt，J=9.6，3.8，H－6），4.90（1 H，dd，J=7.7，3.8，H－3），2.48（2 H，m，H－4），2.48（2 H，m，H－5），1.9（1 H，m，H－8），1.45（1 H，m，H－8），1.3（2 H，m，H－9），1.3（2 H，m，H－10），0.9（3 H，t，J=7.1，H－11）。以上數據與關于蛇床內酯 A的文獻［11－12］一致。

5.3.2 EI－MS對HSCCC分離峰的結構分析

Z－Ligustilide:EI－MS:m/z190.1 ［M+］，161，148，134，105，77，55，Senkyunolide A:EI－MS:m/z192.1 ［M+］，163，135，133，105，79。以上數據與關于Z－蒿本內酯及蛇床內酯A的文獻［13］一致。5.3.3 HPLC對HSCCC分離峰的純度分析

分別精密稱量4號峰和5號峰干燥物質3.1 mg、2.4 mg，用甲醇完全溶解，10 mL 定容，過濾，得供試品溶液。按照文獻［14］給出的高效液相色譜條件，進樣量為 10 μL。

根據面積歸一化法，并且與空白試驗結果進行比對，可以得到蛇床內酯A的純度為99.3%，Z－蒿本內酯的純度為97.7%。

5.3.4 回收率的計算

以分離得到的相對標準品的量與藥材中蛇床內酯A和Z－蒿本內酯實際測得藥材中含量之比，可計算得出蛇床內酯A及Z－蒿本內酯的回收率。計算可知，蛇床內酯 A的回收率較高，可以達到96.61%，相比，Z－蒿本內酯的回收率可以達到80.08%。

6 討論

使用高速逆流色譜技術分離出川芎揮發油中的兩個成分未見報道，我們首次使用此技術，一次性完成兩個成分的分離及制備，得到兩個活性成分——蛇床內酯A和Z－蒿本內酯，并且純度均達到95%以上;蛇床內酯的回收率為96.61%，Z－蒿本內酯的回收率為80.08%，推測殘留一部分在固定相當中。蛇床內酯A與Z－蒿本內酯的穩定性差，使用普通的柱層析分離，耗時長，不易保存和純化;而半制備及制備型液相分離方法成本較高，均不適于快速、大量的制備分離Z－蒿本內酯和蛇床內酯A。而HSCCC分離過程短，避免傳統方法帶來的固相吸附，預處理簡單，成本較低，成分得率高，后處理簡便易行。說明HSCCC對于分離穩定性差的物質具有較大優勢。

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