黃瓜果實成熟衰老過程中幾種物質的變化0王志坤

秦智偉 周秀艷

（1東北農業大學大豆生物學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2東北農業大學園藝學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

衰老是植物生長發育、形態建成和對環境應答反應中一個必要的、主動的過程，是受內外因子直接或間接影響的一種器官或組織逐步走向功能衰退和死亡的變化過程（沈成國，2001）。所有多分子有機體在發育的最后階段都要經歷生理功能的降低，這個過程就是衰老，是一個由基因控制的、有序的過程。衰老包括形態、代謝和生理上的改變，蛋白質和核酸的降解，以及新基因的表達等，這些變化又反過來影響著衰老的進程。植物衰老的生理生化變化是生物體與環境及自身的新陳代謝過程中正常的生理反應（Pennel & Lamb，1997），生理生化變化主要包括葉綠素（Fang et al.，1998）和蛋白質（Lutts et al.，1996）、膜脂（Trippi & Thiamann，1983）和RNA等大分子的分解以及營養物質再利用（Himelblau & Amasino，2001）等。

黃瓜（Cucumis sativus L.）是重要蔬菜品種之一。我國是世界上黃瓜生產面積最大、總產量最高的國家，了解黃瓜果實成熟衰老進程對我國黃瓜生產、貯藏具有重要的理論和實踐意義。黃瓜是非呼吸躍變型果實，果實衰老后，營養物質降解，品質下降，嚴重影響著果實的商品性。研究黃瓜果實成熟衰老進程，明確其衰老過程中各重要生理生化指標的變化特性，對認清黃瓜果實衰老機理，有效延緩果實衰老、延長果實貨架期具有重要意義。

本試驗以兩個黃瓜品種作為試驗材料，主要從膜脂過氧化和大分子降解以及營養物質再利用角度去研究兩個黃瓜品種果實的衰老特性。

1 材料與方法

1.1 材料

以黃瓜品種D0313（授粉后25 d果皮變黃，第1雌花節位為第3～4節，葉片淺綠色，植株抗病性差）和649（授粉后35 d果皮變黃，第1雌花節位為第4～5節，葉片深綠色，植株抗病性強）為材料，種子由東北農業大學園藝學院黃瓜課題組提供。

1.2 設計與管理

試驗在東北農業大學設施園藝中心進行。2005年3月25日播種，4月2日分苗，5月2日黃瓜三葉一心時定植在塑料大棚內，采用隨機區組排列，3次重復，5月22日黃瓜初花期開始授粉，掛牌標記。選取長勢一致，同天授粉的黃瓜作為試驗材料，每隔5 d取樣1次。

將每個瓜縱切成1/2、1/4、1/8，然后取其中一份的頭部、中部和尾部1 cm長的小塊切碎，混合均勻，用于各項生理生化指標的測定，每個指標測定取3個瓜，3次重復。2006年3月在溫室內進行重復試驗。

1.3 測定項目

果實可溶性蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍染色法（王晶英 等，2002）；脂氧合酶（LOX）活性的測定參照Surrey（1963）的方法；谷氨酰胺合成酶（GS）活性的測定參照O’Neal和Joy（1973）的方法。

1.4 數據分析

試驗數據分析用Excel和DPS 3.01數據處理軟件完成。

2 結果與分析

2.1 黃瓜果實成熟衰老進程中外觀形態的變化

兩個黃瓜品種成熟衰老過程中果實外觀形態變化不盡相同。試驗中，D0313果實停止生長的時間較649早7 d左右，兩個品種果皮顏色變黃的時間分別為授粉后25 d和35 d。整個發育過程，D0313果皮變黃速度明顯快于649，但果實中種子的發育進程幾乎是同步，授粉后30d左右，果實內種子開始成熟（種皮變硬，種胚發育完全），但D0313的種子飽滿度較同期649種子的飽滿度差一些。

2.2 黃瓜果實成熟衰老進程中脂氧合酶活性變化

植物脂氧合酶（LOX）活性變化與組織衰老密切相關（羅云波，1994；陳昆松 等，1999；Fukuchi-Mizutani et al.，2000），以LOX催化的細胞膜過氧化作用可以形成氫過氧化物、自由基和茉莉酸（JA）等促進衰老物質（Grechkin，1998），直接或間接地參與了組織的衰老進程。由于LOX可以形成茉莉酸等信號傳導物質，啟動膜脂過氧化作用，因此認為是果實衰老早期鑒定指標之一（宋德穎 等，2007），較其他生理指標變化較早。本試驗中兩個黃瓜品種的LOX活性變化趨勢相同（圖1）。授粉后15 d，LOX活性開始上升，授粉后20～25 d達到最大值，然后呈下降趨勢，在生育后期略有上升。在果實成熟衰老的過程中，D0313的LOX活性高于649，說明D0313啟動膜脂過氧化作用的程度高于649。

2.3 果實成熟衰老進程中可溶性蛋白質含量變化

可溶性蛋白質含量和植物衰老關系密切。Halevy和Mayak（1981）認為，蛋白質含量下降是植物衰老的一個重要指標。由圖2可以看出，D0313可溶性蛋白質含量在授粉后15～25 d變化不明顯；25 d以后下降顯著；到授粉后50d，可溶性蛋白質含量僅為初期的22.01 %。649在授粉后15～30d可溶性蛋白質含量變化也不明顯，30d后開始迅速下降，到授粉后50d可溶性蛋白質含量為初期的44.06 %。無論是可溶性蛋白質開始顯著下降的時間還是下降的速度，D0313都早于且快于649。

圖1 黃瓜果實成熟衰老過程中LOX活性變化

圖2 黃瓜果實成熟衰老過程中可溶性蛋白質含量變化

2.4 黃瓜果實成熟衰老過程中谷氨酰胺合成酶活性變化

果實成熟衰老時，蛋白質等大分子物質降解為氨基酸等小分子物質，為氮素轉移提供條件。谷氨酰胺合成酶（GS）與內源性蛋白降解和氨基酸分解代謝產生的氨的再同化和氨的轉運有關，是衰老末期物質再利用的體現。兩個品種 GS活性的變化趨勢大體相同（圖 3）。D0313授粉后15～35 d，649授粉后15～40d，GS活性基本維持不變，表明此階段果實內部沒有發生物質轉移及再利用；D0313授粉后35～40d，649授粉后40～45 d，GS活性急劇升高，說明此時營養物質后期的再利用迅速增多，而且也與大分子物質劇烈降解時期基本吻合，此時黃瓜果實已進入衰老后期。

圖3 黃瓜果實成熟衰老過程中GS活性變化

3 結論與討論

自由基衰老學說認為，衰老過程即活性氧代謝失調累積的過程。膜脂過氧化作用及對其具有清除功能的抗氧化酶系統近年來成為植物衰老機理研究的重要方面之一。在正常情況下，形成的大部分會被SOD清除掉，使降低到一定的穩態濃度。而在植物衰老過程中，自由基產生和清除反應之間的平衡遭受破壞，SOD活性降低，保護系統受到消弱，濃度大大增加，引發或加劇膜脂過氧化作用和膜脂脫脂化，膜脂過氧化的中間產物自由基和最終產物 MDA都會嚴重損傷細胞膜（陳少裕，1991），細胞膜透性的變化可以反映出細胞受傷害的程度。由于膜完整性受到破壞，胞內物質發生滲漏，引起果實浸出液電導率的急劇增加。

李艷秋等（2006）測定了黃瓜果實成熟衰老進程中SOD、MDA和組織相對電導率的變化，結果表明授粉15 d時，D0313的SOD活性低于649；從20d開始，D0313的SOD活性快速上升；授粉后25 d，D0313的SOD活性開始下降。前期SOD活性的上升表明了植物自身對逆境的一種適應能力，以維持體內各種代謝之間的平衡。但在后期這種平衡遭到破壞，SOD活性降低，清除活性氧能力下降，造成細胞內活性氧積累而產生毒害，引起細胞膜過氧化破壞作用，果實快速衰老。D0313的MDA含量顯著高于649，二者變化趨勢較一致：前期積累緩慢，后期積累迅速，但D0313的 MDA含量上升速度顯著快于 649。MDA的積累是過氧化作用加劇、膜受到損傷的重要表現，其含量越高表明膜脂過氧化作用越強。因此，表明在果實衰老過程中，D0313果實清除自由基的能力較差，造成自由基對細胞的傷害程度大，這可能是其早衰的一個原因。黃瓜品種D0313和649的果實相對電導率變化趨勢一致，均呈上升趨勢，不同的是，D0313的相對電導率大于649，且上升速度變化快，表明D0313電解質滲透較嚴重（李艷秋 等，2006）。

結合李艷秋等（2006）的研究內容，本試驗又選擇了啟動膜脂過氧化作用的關鍵酶LOX進行研究，結果表明，黃瓜果實授粉后15 d，LOX活性開始增加，說明此時膜脂過氧化作用開始啟動，但由于保護酶SOD的活性氧清除作用，使果實的膜脂過氧化作用并沒有增強，MDA含量維持穩定。直至授粉后30～35 d，果實SOD活性開始迅速下降，導致超氧化物自由基水平的上升，加劇了膜脂過氧化作用，MDA含量逐漸升高。膜脂過氧化程度的增加，導致膜完整性遭到破壞，胞內物質發生外滲，引起果實相對電導率的急劇增加，授粉后35～40d，組織相對電導率迅速上升。果實相對電導率的迅速升高很可能是果實衰老后期失水的前奏，而RNA和蛋白質降低才是衰老開始的標志。這就是說在原生質膜完整性破壞之前，衰老已經開始。從前人對衰老的研究及本試驗研究的結果看，膜脂過氧化是導致黃瓜果實衰老的主要生理原因之一。

國內外不少學者都把可溶性蛋白質含量作為衰老的重要指標之一（Himelblau & Amasino，2001）。有研究表明，可溶性蛋白質含量降解損失量占衰老過程中蛋白質降解損失總量的90%～95 %，因此反映蛋白質降解水平的一個重要指標就是可溶性蛋白質含量的變化（沈成國，2001）。本試驗中兩個黃瓜品種可溶性蛋白質含量先是保持穩定，說明此階段蛋白質合成與分解是平衡的，果實基本功能穩定；授粉后25 d和30d，D0313和649的可溶性蛋白質含量迅速下降，蛋白質含量的大幅度下降，表明此時黃瓜果實細胞內大分子物質開始迅速瓦解。

植物衰老的另外一種表現就是在衰老后期，對內源性蛋白降解和氨基酸分解代謝產生的氨的再同化和氨的運轉，也就是在衰老末期物質的再利用。在高等植物中，谷氨酰胺合成酶由于對氨的高親和力以及強有力地把氨滲入到有機酸中的能力，因此被認為是氨同化的關鍵酶。GS催化產生的谷氨酰胺不僅是存貯蛋白降解產生的游離氨的受體，也是植物體內氨轉運的主要形式。GS活性與內源性蛋白降解和氨基酸分解代謝產生的氨的再同化和氨的轉運有關。本試驗中兩個黃瓜品種果實GS活性在授粉后35～40d開始迅速升高，而此時間也正是可溶性蛋白質含量急劇下降的時期。

在不同的品種中除了本身的遺傳特性以及栽培地的環境條件不同外，還由于蛋白質降解、膜脂過氧化和酶系統活性水平的差異，從而造成膜系統穩定性不同，最終表現為果實衰老進程的不同。這可能也解釋了本試驗中黃瓜品種D0313比649早衰的原因。因此，通過對衰老特性的研究，采用一定的措施，增強酶活性、維持自由基產生與清除之間的平衡，可能是延長黃瓜果實衰老的有效途徑。

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