霞水母提取物抗凝血作用的初步研究

湯魯宏,鄧 超 ,林 丹 ,陳 偉

江南大學醫藥學院藥化與藥分研究室,無錫 214122

據世界衛生組織(WHO)調查發現,心腦血管病是人類致命的頭號“殺手”。目前臨床上采用的抗血栓藥物如阿司匹林有明顯的胃腸道不良反應;抗凝血藥肝素,近年來發現不能抑制與纖維蛋白結合的凝血酶,這已成為血栓復發的關鍵因素,因此,研究安全有效、適于長期甚至終生服用的抗凝血、抗血栓藥物具有重要意義[1]。據報道,鯊魚軟骨中含有大量的黏多糖,具有抗凝血、溶血栓等生理功能;張新江從陶氏太陽海星(Solaster dawsoni Verril1)中分離制得的海星酸性黏多糖有緩和的抗凝血作用;包承鑫報道從刺參[Stichopus japonicus(Selenka)]體壁中提取的一種黏多糖,對彌漫性血管內凝血(DIC)和血栓形成具有較強的抑制效果。

霞水母(Cyanea nozakii)俗稱麻蜇,屬于腔腸動物門(Coelenterata)缽水母綱(Cyphozoa)、霞水母屬(Cyanea),其傘狀體的直徑可達 1.5～2 m,是水母類群中最大的一種。關于以霞水母(Cyanea nozakii)為天然海洋生物資源,分離提取其生物體的各種成分并對其生物活性物質進行系統篩選和評價的研究,在國內外尚未見任何報導。本實驗以霞水母這一災害物種為原料,對從中提取的活性物質進行了抗凝血作用的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

霞水母:采于南通呂四港,冷凍保存。霞水母提取物:參照相關文獻方法并進行改進,霞水母通過酸溶酶解后進行冷凍干燥得到的淡棕色粉末,使用前溶解在蒸餾水中(具體的制備方法參見已向國家申請的專利:200710171189.0)。已經過急性毒性實驗證明該提取物無毒或毒性很小,最大安全劑量在15000 mg/kg以上。

1.2 實驗動物

健康雄性 ICR小白鼠,4 w,體重18～22 g,由揚州大學比較醫學中心提供[批準號:SCXK(蘇)2007-0001]。購回后飼養 3 d開始實驗以適應環境。

1.3 實驗儀器和試劑

注射器(蘇州林華塑料制品有限公司);電子精密天平(酶特洛-托利多儀器(上海)有限公司);秒表計時器(上海手表五廠);TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);玻璃毛細管(華西醫科大學儀器廠)APTT、PT試劑盒(上海太陽生物技術有限公司)生理鹽水又本實驗室自制。

1.4 實驗方法

1.4.1 劑量設計及實驗動物分組

取 50只小白鼠隨機分為 5個組,每組 10只。其中 3組為霞水母提取物低、中、高劑量組,第 4組為空白對照組,第 5組為陽性對照組。霞水母提取物試驗組按人體日食推薦量 7 g/人(成人按每人 70 kg體重計)來設計動物實驗劑量,分別為 50、100、200mg/kg(相當于人體日食推薦量的 0.5、1、2倍),空白對照組給予 0.5 mL/只生理鹽水,陽性對照組給予 0.5mL/只華法林,其劑量根據人體體表面積(成人按每人 70 kg體重計)是小鼠體表面積(20 g)的 387.9倍來計算,人體服用的預防劑量為 3mg/d,換算成小鼠的劑量為 0.4mg/kg。然后進行下列各項抗凝血指標的測定。

1.4.2 體內出血時間測定

采用小鼠斷尾法。小鼠連續灌胃 7 d后,將小鼠固定,用利剪將小鼠尾尖 3 mm(提前標記)處橫斷,待血液自行溢出開始計時。每隔 30 s用濾紙吸去血滴一次,直至血液自然停止,以濾紙吸時無血為結束時間,此時間為體內出血時間[3]。

1.4.3 體內凝血時間測定

采用毛細玻管法。小鼠連續灌胃 7 d后,用毛細玻管從小鼠眼睛內眥取血,自血液進入毛細管開始計時至充滿時離開,每隔 30 s從一端斷毛細管一次,當毛細玻管內血液出現絲狀物時計時結束,為凝血時間[3]。

1.4.4 體外凝血時間測定

取試驗樣品、生理鹽水(空白對照組)、華法林(陽性對照組)各 0.1m L,分置于 10支試管中,取正常小鼠拔眼球取血,將血液直接滴入刻度試管中至約 0.7mL,輕輕混勻并計時,每隔 5 s傾斜試管一次,觀察表層血液是否沿試管移動,至凝固時停止計時,為體外凝血時間[3]。

1.4.5 APTT(活化部分凝血活酶時間)、PT(凝血酶原時間)的測定

按照上述實驗動物分組方案,連續灌胃 3 d。末次給藥1 h后,從小鼠眼睛內眥采血 1mL,置于含有1/10體積 0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝液(1份抗凝液 +9份全血)的塑料離心管中,輕輕顛倒混勻,3000 rpm離心 15 min。收集上層液,-20℃凍存。然后按照試劑盒操作逐項進行測定。

1.4.6 實驗數據處理

實驗數據用 SPSSv11.0進行單因素方差分析統計處理。

2 結果與討論

2.1 體內出血時間測定

試驗組小鼠的體內出血時間均比空白對照組的延長,且低、中劑量組與空白對照組的差異具有高度顯著性 (P＜0.01),高劑量組與空白對照組的差異具有顯著性(P＜0.05)。表明霞水母提取物能延長小鼠的體內出血時間,增強其抗凝血功能。試驗組各劑量組之間差異不顯著(P＞0.05)。試驗組小鼠的體內出血時間均比陽性對照組縮短,結果見表 1。

表 1 霞水母提取物對小鼠體內出血時間的影響(n=10,±s)Table 1 Effect of extract from Cyanea nozakii on the bleeding time in vivo ofm ice(n=10±s)

表 1 霞水母提取物對小鼠體內出血時間的影響(n=10,±s)Table 1 Effect of extract from Cyanea nozakii on the bleeding time in vivo ofm ice(n=10±s)

注:與空白對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01 Note:Compared with normal group*P＜0.05,**P＜0.01

組別Group劑量(mg/kg?d)Dosage時間(s)Time空白對照組Normal control 0 746.88±196.83低劑量組Low dosage 50 1395.14±211.71**中劑量組Middle dosage 100 1987.01±313.80**高劑量組High dosage 200 1265.73±265.00*陽性對照組Positive control 0.4 2112.25±102.13**

2.2 體內凝血時間測定

試驗組的小鼠體內凝血時間均比空白對照組的延長,且中劑量組與對照組的差異具有高度顯著性(P＜0.01),表明霞水母提取物能延長小鼠體內凝血時間。其中低劑量組與中劑量的差異具有高度顯著性(P＜0.01),中劑量組與高劑量組具有顯著性差異(P＜0.05),與陽性對照組相比,小鼠的體內凝血時間有所縮短,結果見表 2。

表 2 霞水母提取物對小鼠體內凝血時間的影響(n=10±s)Table 2 Effectof extract from Cyanea nozakii on the blood clotting time in vivo ofm ice(n=10±s)

表 2 霞水母提取物對小鼠體內凝血時間的影響(n=10±s)Table 2 Effectof extract from Cyanea nozakii on the blood clotting time in vivo ofm ice(n=10±s)

注:與空白對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01 Note:Compared with normal group*P＜0.05,**P＜0.01

組別Group劑量(mg/kg?d)Dosage時間(s)Time空白對照組Normal control 0 345.53±103.59低劑量組Low dosage 50 383.36±144.13中劑量組Middle dosage 100 649.96±124.51**高劑量組High dosage 200 427.95±86.55*陽性對照組Positive control 0.4 729.31±36.29**

2.3 體外凝血時間測定

試驗組小鼠體外凝血時間均高于對照組,且中劑量組、高劑量組與對照組比較,差異有高度顯著性(P＜0.01),表明霞水母提取物能夠延長小鼠體外凝血時間。其中低劑量組與高劑量之間的差異具有高度顯著性(P＜0.01)。各試驗組的小鼠體外凝血時間均比陽性對照組縮短,結果見表 3。

表 3 霞水母提取物對小鼠體外凝血時間的影響(n=10±s)Table 3 Effectof extract from Cyanea nozakiion the blood clotting time in vitro ofmice(n=10,±s)

表 3 霞水母提取物對小鼠體外凝血時間的影響(n=10±s)Table 3 Effectof extract from Cyanea nozakiion the blood clotting time in vitro ofmice(n=10,±s)

注:與空白對照組比較**P＜0.01 Note:Compared with normal group**P＜0.01

組別Group劑量(mg/kg?d)Dosage時間(s)Time空白對照組Normal control 0 22.94±6.50低劑量組Low dosage 50 39.02±9.79中劑量組Middle dosage 100 71.60±2.84**高劑量組High dosage 200 143.30±25.78**陽性對照組Positive control 0.4 156±26.30**

2.4 APTT、PT測定

試驗組中各劑量組的 APTT、PT值均比空白對照組延長(P＜0.05),說明霞水母提取物能夠抑制內源性途徑和外源性途徑凝血酶的產生,且對其內源性途徑的抑制作用大于外源性途徑。其中,低劑量組與中劑量組的 APTT比較有顯著性差異(P＜0.05),各劑量組的 PT值之間無顯著性差異(P＞0.05)。陽性對照組主要是通過抑制外源性途徑凝血酶的產生,結果見表 4。

表 4 霞水母提取物對小鼠APTT、PT值的影響(n=10,±s)Table 4 Effectof extract from Cyanea nozakii on the APTT、PT ofm ice(n=10±s)

表 4 霞水母提取物對小鼠APTT、PT值的影響(n=10,±s)Table 4 Effectof extract from Cyanea nozakii on the APTT、PT ofm ice(n=10±s)

注:與空白對照組比較 *P＜0.05,**P＜0.01 Note:Compared with normal group*P＜0.05,**P＜0.01

組別Group劑量(mg/kg?d)Dosage活化部分凝血活酶時間(s)APTT延長Prolong凝血酶原時間(s)PT延長Prolong空白對照組 Normal control 0 28.79±4.12 - 11.83±1.52 -低劑量組 Low dosage 50 50.25±10.93** 74.53% 17.66±4.12* 49.27%中劑量組Middle dosage 100 59.73±6.43** 107.46% 21.86±3.41** 84.78%高劑量組 High dosage 200 53.15±6.43** 84.62% 20.03±1.82** 69.37%陽性對照組 Positive control 0.4 48.23±4.38** 67.52% 23.12±0.92** 95.44%

3 結論

本實驗首先測定了霞水母提取物對小鼠體內出血時間、體內凝血時間及體外凝血時間的影響,研究結果顯示該提取物能夠顯著延長小鼠體內出血時間、體內凝血時間及體外凝血時間,因此初步認為霞水母提取物具有抗凝血作用。

APTT和 PT是臨床凝血功能檢測中最常用的 2個參數。其中 APTT主要用于檢測機體的內源性凝血系統,其延長或縮短分別反映凝血因子Ⅱ、V、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ的血漿水平降低或增加。PT則檢測機體的外源性凝血系統,其延長或縮短分別反映凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ的血漿水平降低或增加。本研究表明,霞水母提取物對小鼠 APTT和 PT均有顯著影響,提示該提取物的凝血機理可能是通過內源性凝血途徑和外源性凝血途徑共同起作用的。

綜上可知,霞水母提取物中含有具抗凝血活性的有效成分,但其化學本質及其發揮抗凝血作用的詳細機制還需進一步探討。

1 WeiYX(魏玉西),Li J(李敬),Zhao AY(趙愛云),et al.The progress of investigate the anticoagulated blood of active compound from marine life.Chin JMarine Drugs(中國海洋藥物雜志),2006,25:47-50.

2 Lin XY(藺新英),Guo DM(郭冬梅),Su WN(蘇維娜).Study on the anti-coagulation effectofextract from black curd beans.Chin J Gerontology(中國老年學雜志),2006,26:1081-1082.