白芷中四種線型呋喃香豆素類成分藥理作用研究

王夢月,賈敏如,馬逾英,李曉波

1成都中醫藥大學藥學院,成都 610075;2上海交通大學藥學院,上海 200240

白芷為一常用中藥,用于鼻淵頭痛、風濕痹痛等病的治療,療效確切。白芷的主要化學成分為香豆素,我們前期研究首次發現白芷總香豆素具有明顯的鎮痛和解痙作用,能明顯對抗熱板、冰醋酸所致小鼠疼痛及 BaCl2所致兔腸平滑肌痙攣[1];秦旭華、Okuyama T等也報道白芷總香豆素具有明顯的鎮痛作用[2]、抗腫瘤作用[3]。但白芷鎮痛、解痙、抗腫瘤的活性成分尚不清楚。白芷的主要香豆素類成分為異歐前胡素(isoimperatorin,1)、歐前胡素(imperatorin,2)、白當歸素(byakangelicin,3)、水合氧化前胡素(oxypeucedanin hydrate,4)等線型呋喃香豆素[4](圖1)。為進一步探討白芷鎮痛、解痙、抗腫瘤的活性成分,從而為白芷的質量控制提供科學依據,我們對上述 4種呋喃香豆素進行了鎮痛、解痙、抗腫瘤實驗,本文報道研究結果。

圖 1 4種呋喃香豆素結構式Fig.1 The structure of four furocourmarins

1 實驗材料

1.1 實驗藥材

2002年 7月采于四川省遂寧市川白芷 GAP基地,經成都中醫藥大學藥學院賈敏如教授鑒定為杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根,憑證標本保存于成都中醫藥大學藥學院。根曬干備用。

1.2 細胞株

1.3 實驗動物

昆明種小鼠:清潔級,體重 20±2 g,由成都中醫藥大學醫學實驗動物中心提供[動物合格證:川實動管 2003(6)號];新西蘭兔:清潔級,體重 2.0～2.5 kg,由中國醫學科學院輸血研究所提供(動物合格證:川實動管 99-11號)。

1.4 藥物、試劑及耗材

硫酸羅通定注射液(廣東博羅先鋒藥業集團有限公司,批號:020408,使用前用生理鹽水配成 4 mg/mL備用),二甲基亞砜(DMSO,常州市科豐化學試劑廠),3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT,美國 AMRECO公司),RPMI1640培養基(美國 GibicoBRL公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),乙酰膽堿(廣州化學試劑公司),氯化鋇(Sigma公司),臺氏液(新鮮配制)。其余化學試劑均為分析純。

1.5 主要儀器

SW-CJ-1C超凈工作臺(蘇州儀器廠),BL-410生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司),YLS-6A智能熱板儀(山東省醫學科學研究院設備站),5701水套式 CO2培養箱(美國 Thermo Forma公司),ELX800酶標儀(美國 Bio-Tek公司)。

2 實驗方法

2.1 統計學處理

應用 SPSS 11.5進行 One-Way ANOVA檢驗及IC50的計算。

2.2 藥理供試樣品的制備

杭白芷根 30 kg,粉碎成粗粉,150 L乙醇回流提取 3次,回收乙醇得醇浸膏 1334 g。醇浸膏懸浮于水,石油醚(30～60℃)萃取,棄去石油醚部分;繼續以醋酸乙酯萃取,回收溶劑得總香豆素 477 g。取總香豆素 200 g,行硅膠柱層析,石油醚洗脫,棄去洗脫流份 ;繼用石油醚-醋酸乙酯 (95:5、80:20、60:40、40:60)洗脫,分別得異歐前胡素 1250mg、歐前胡素2345 mg、白當歸素 1850 mg、水合氧化前胡素 3680 mg。上述成分均經1H NMR、13C NMR、EI-MS等方法確定結構。

4種香豆素均加入 1%的吐溫-80生理鹽水溶液,超聲溶解,配成 0.5%的溶液供鎮痛、解痙實驗;用 DMSO配制成所 40、10、2.5、0.625、0.156 μg/mL供抗腫瘤實驗。

2.3 鎮痛實驗

2.3.1 醋酸扭體法

排除標準：(1)術前檢查發現內科疾病者；(2)對鎮痛類藥物過敏者；(3)發現腕管內腫瘤壓迫者或伴有術前急慢性感染者。

100只小鼠(雌雄各半),隨機分為 10組,每組10只。陰性對照組腹腔注射 10 g/kg(體重)的 1%吐溫 80生理鹽水溶液,其余組按表 1劑量腹腔注射給藥。30min后腹腔注射 0.6%醋酸溶液 0.2mL/只。觀察并記錄注射醋酸溶液后的扭體潛伏期及20min內出現扭體反應的次數。實驗完畢,按下式計算藥物鎮痛百分率:鎮痛率 =(對照組扭體次數-給藥組扭體次數)/對照組扭體次數 ×100%[5]。

2.3.2 熱板法

選擇對 50℃熱板痛覺反應在 10～30 s的小鼠100只,隨機分為 10組,每組 10只。按表 2劑量腹腔注射給藥(陰性對照給予 1%吐溫 80生理鹽水溶液),給藥前及給藥后 15,30,60,90 min測定痛反應潛伏期,按下式計算痛閾提高百分率:痛閾提高百分率 =(給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值)/給藥前平均痛閾值 ×100%[5]。

2.4 解痙實驗

取兔回腸一段,置盛有冷臺氏液的平皿中,分離腸系膜,用臺氏液沖洗干凈,將腸管剪成長 2～2.5 cm小段。小段腸管兩端穿線結扎,一端系于通氣鉤上,放入恒溫臺氏液中,另一端連接 BL-410生物機能實驗系統。調節臺氏浴槽內腸肌張力,觀察正常腸肌活動。待自主活動穩定后,記錄一段正常舒縮曲線,然后每段腸管按 A、B、C、D順序進行實驗。每次加藥液前均用臺氏液沖洗腸肌 3次,待舒縮恢復至用藥前水平后再加下組試驗藥液,記錄舒縮活動曲線[6]。

A:加入 0.5%異歐前胡素生理鹽水溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 m L,觀察并記錄舒縮曲線。觀察后用臺氏液沖洗。

B:加入 100μg/mL的乙酰膽堿液 0.4m L,當腸肌收縮顯著時加入 0.5%異歐前胡素生理鹽水溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2m L。觀察后用臺氏液沖洗。

C:加入 100mg/mL的氯化鋇液 0.2mL,待收縮顯著時加入 0.5%異歐前胡素生理鹽水溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2m L。

D:換腸管,分別取歐前胡素、白當歸素、水合氧化前胡素按上述順序進行實驗。

2.5 抗腫瘤實驗

取對數生長期細胞消化,計數,5 000個每孔鋪于 96孔板,在 37℃、含 5%CO2的培養箱培養 24 h后,加入藥物(DMSO溶解),每個藥物濃度設 3個平行孔,連續培養 48 h后,每孔加入 20μL 5 g/L的MTT,繼續培養 4 h,貼壁細胞傾去培養基后每孔加入 150μL DMSO,輕輕震搖;懸浮細胞每孔加入 50 μL的三聯液(10%SDS-5%異丁醇-0.1%鹽酸),37℃培養箱中過夜。用酶標儀檢測各孔 570 nm吸光度(A)值,并按下式計算抑制率:抑制率 =(對照組A值-實驗組 A值)/對照組 A值 ×100%[7]。

3 實驗結果

3.1 鎮痛實驗

3.1.1 醋酸扭體法

結果見表 1。四種香豆素均顯著減少醋酸所致小鼠的扭體次數。異歐前胡素、歐前胡素還能明顯延遲小鼠扭體的出現,而水合氧化前胡素、白當歸素則無明顯作用。4種呋喃香豆素類成分中歐前胡素的作用最強,75mg/kg的鎮痛強度超過 40mg/kg的顱痛定。

表 1 四種呋喃香豆素對醋酸所致小鼠疼痛的影響Table 1 Effect on rats'pain caused by acetic acid

3.1.2 熱板法

結果見表 2。異歐前胡素及歐前胡素均有顯著的鎮痛作用,能明顯抑制熱板法所致小鼠疼痛,歐前胡素的作用明顯強于異歐前胡素。白當歸素、水合氧化前胡素無明顯作用。

表 2 四種呋喃香豆素對熱板致小鼠疼痛反應的影響Table 2 Effect on rats'pain caused by hot board

注:與對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note:*P＜0.05,**P＜0.01 vs NSgroup.

3.2 解痙實驗

結果:4種香豆素對正常兔腸平滑肌舒縮均無明顯影響;均不能顯著緩解乙酰膽堿引起的兔腸平滑肌痙攣;異歐前胡素、歐前胡素、水合氧化前胡素液能明顯緩解氯化鋇引起的腸管平滑肌痙攣,白當歸素無明顯作用。

3.3 抗腫瘤實驗

結果見表 3。異歐前胡素、水合氧化前胡素均有抗腫瘤作用,對 HL-60、HELA、P388、A549等 4種細胞株的生長均有顯著抑制作用,并呈明顯的量效關系。而歐前胡素、白當歸素未觀察到明顯作用。

表 3 四種呋喃香豆素對腫瘤細胞株的抑制作用(n=3)Table 3 The inhibition ratio of 4 furocoumarins on 6 tumor cells

注:+有活性;-無活性。Note:+positive;-Negative.

4 討論

白芷及其某些復方制劑在臨床上廣泛用于頭痛、牙痛、三叉神經痛等多種疼痛的治療,療效顯著,但目前白芷鎮痛的有效成分尚不明確。本實驗首次發現白芷中的歐前胡素、異歐前胡素具有明顯的鎮痛作用,除能直接對抗由熱、醋酸等物理、化學刺激引起的疼痛外,還能緩解平滑肌痙攣,是白芷鎮痛的活性成分。此外,本實驗還發現白芷中的異歐前胡素、水合氧化前胡素具有明顯抗腫瘤作用。上述研究為白芷的臨床應用提供了科學依據。

目前中國藥典僅規定白芷中歐前胡素的含量,我們發現異歐前胡素、水合氧化前胡素等成分亦具有明顯的鎮痛、解痙活性。文獻也報道異歐前胡素具明顯解痙作用及光敏活性[8]。結合白芷的功效,建議將異歐前胡素、水合氧化前胡素也作為白芷質量控制指標。

本文所采用的 4種香豆素為白芷的主要成分,結構均為線型呋喃香豆素,母核相同,僅取代基及取代位置不同。但它們在鎮痛、緩解平滑肌痙攣、細胞毒等方面的作用均有明顯差異,提示取代基的類型及取代位置對線型呋喃香豆素的生物活性具有顯著影響。白芷中線型呋喃香豆素類成分的構效關系值得進一步研究。

致謝抗腫瘤活性測試由國家新藥篩選中心完成;乙醇提取工作由四川省人民醫院藥學部完成;成都中醫藥大學黃國鈞教授、唐聲武教授、蔣桂華副教授提供了必要幫助,在此一并表示感謝。

1 Wang MY(王夢月),Jia MR(賈敏如),Ma YY(馬逾英),eta l.Pharmacological effect of the total coumarins in radix Angelicae dahuricae.LiShiZhen Med Mater Med Res(時珍國醫國藥),2005,16:954-956.

2 Qin XH(秦旭華),Li ZL(李祖倫),Zhu GF(朱果夫),et al.Study on the pharmacodynam ics of total coumarin of Radix angelicae dahuricae in treatingmigraine.JSichuan Trad Chin Med(四川中醫),2008,26(6):4-6.

3 Okuyama T,Takata M,Nishino H,et al.Studies on the antitumor-p romotingactivity of naturally occurring substancesⅡ.Inhibition of tumor p romtoter-enhanced phospholipidmetabolism by umbelliferousmaterials.Chem Pharm Bull,1990,38(4):1084.

4 Wang MY(王夢月),Jia MR(賈敏如).Research progress on chem ical constituents of Radix angelicae dahuricae.J Chin Med Maters(中藥材),2002,25:446-449.

5 Zhang MF(張明發),Shen YQ(沈雅琴),Tang CK(湯臣康).Anti-inflammatory and analgesic actions of berberine.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發),1990,2(1):49-53.

6 Chen Q(陳奇),Shen YJ(沈映君),Sun XH(孫學蕙),et al.TCMs Pharmacological Experiment(中藥藥理實驗).Guiyang:Guizhou People's Publishing House,1988.105-107.

7 Xu SY(徐叔云),Bian RL(卞如濂),Chen X(陳修).Pharmacological ExperimentMethodology,3rd ed(藥理實驗方法學).Beijing:People's Medical Pub lishing House,2002.1784-1786.

8 Wang JW(江紀武),Xiao QX(肖慶祥).Handbook of Active Constituents in Phytomedicine(植物藥有效成分手冊).Beijing:People'sMedical Publishing House,1986.603.