粵藍鏈霉菌代謝產物的抗菌抗腫瘤活性及相關基因的初步研究

鄧名榮,郭 俊,朱紅惠*

1華南理工大學生物科學與工程學院,廣州 510006;2廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應用重點實驗室廣東省微生物應用新技術公共實驗室,廣州 510070

鏈霉菌(Streptomycete)能產生抗菌、抗腫瘤、抗蟲、免疫抑制等廣泛生理活性的代謝產物,是生物活性物質的主要產生菌[1]。鏈霉菌產生的許多活性代謝產物是通過聚酮合酶(polyketide synthases,PKSs)途徑和非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPSs)途徑產生的[2]。雖然隨著已知活性物質的不斷增加,發現新的活性物質變得越來越困難[3-5],但是包括鏈霉菌在內的微生物仍然是新活性物質的主要來源[6]。在實際研究中,微生物的不同種甚至是同種不同株之間所產生的天然產物都有很大不同,商業上重要的未知天然產物的發現,往往是在篩選過程中獲得了新的微生物菌株。“新菌株(Novel Strains)→新天然產物(Novel Natural Products)→商業上的成功(Commercial Success)”的篩選模式已被廣泛接受[7]。本實驗室分離到一株鏈霉菌新種,能大量產生罕見的水溶性紫羅蘭藍色素,該菌命名為粵藍鏈霉菌(Streptomyces vietnamensis)[8]。本文報道了該菌代謝產物的抗菌活性及抗腫瘤活性,并對該菌的 PKS和 NRPS相關基因進行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞

粵藍鏈霉菌 GIMV4.0001T,克隆宿主菌大腸桿菌(Escherichia coli)JM109;抗菌活性測試菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)AS1.16、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)ATCC6633、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)AS1.634、大腸桿菌 ATCC8739、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)ATCC13312、銅綠假單胞(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027、甘藍黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)、白色念珠菌(Candida albicans)ATCC10231;抗腫瘤活性測試細胞:人宮頸癌 HeLa細胞系,均由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養基

1.1.3 試劑與儀器

薄層層析(TLC)硅膠 GF254購自青島海洋化工廠,乙酸乙酯等化學試劑均為分析純(廣東光華化學廠有限公司),萃取物在 Buchi R200旋轉蒸發儀上濃縮;抗腫瘤試驗光吸收值在 LAMBDA E型酶標儀上測定;Taq酶、pMD18-T、內切酶等購自寶生物工程(大連)有限公司;凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司;PCR在 eppendorf Mastercycler 5333型 PCR儀上進行。引物合成、測序(ABI 3730)均由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 發酵和提取

培養 36 h的種子液按5%接種于高氏合成一號液體培養基中,28℃,180 r/min,振動培養 7 d,共發酵 2 L,發酵液經離心 (6000 g、20min)、過濾,使菌液分離。發酵上清液用乙酸乙酯萃取四次,50℃旋轉濃縮成粗提物,得率約為 1 g/L。

1.2.2 抗菌活性測定

采用瓊脂糖擴散法。冷卻至 45℃的培養基,加入終濃度約 0.5～3×106cfu/mL的菌體,混勻、倒板,每皿 20 m L,制成含菌平板。培養基凝固后,打孔器打孔(φ5 mm),在孔內加入待測樣品,20μL/孔,在各菌的最適生長溫度培養 24 h,測定抑菌圈的直徑。同時以 100、50μg/mL氨芐青霉素為對照。

1.2.3 TLC-生物顯影

取乙酸乙酯粗提物溶解在適量甲醇中,毛細管上樣,在氯仿/甲醇(8:1)中展開,展層完畢的 TLC板,與含有金黃色葡萄球菌(約 2×106cfu/mL)的NA平板接觸一段時間后,移除 TLC板,含菌平板于37℃培養 24 h,進行生物自顯影。

Step1:提供12個警告界面I1、I2， …I12，由核電專家分別給12個警告界面按照上述7個評價因素進行評價得分，得到專家評判矩陣A。

1.2.4 抗腫瘤活性測定

采用 MTT法。癌細胞胰酶消化后,配制成 5×104個細胞/mL的細胞懸液,在 96孔板中,每孔加入 200μL細胞懸液,空白對照組加入培養液,置5%CO2、37℃的培養箱中培養 24 h,加入不同濃度(0、50、100、200、400 μg/mL)的乙酸乙酯粗提物,以10mg/mL 5-氟尿嘧啶為陽性對照,每孔加入樣品 10 μL,每個樣品 5個重復,培養 44 h后加入 5 mg/mL的 MTT溶液 20μL,繼續培養 4 h后,吸去培養液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL,150 r/m in振蕩 30min,在酶標儀上測定其 OD490值(以空白對照組調零)。細胞生長抑制率 =(1-實驗組/細胞對照組)×100%。

1.2.5 PKS/NRPS基因的克隆及分析

粵藍鏈霉菌基因組 DNA的提取參照文獻[9]。根據文獻[10,11]及自行設計引物,擴增 I型和Ⅱ型PKS基因及 NRPS基因(表 1)。PCR反應體系:10×PCR Buffer(含 20 mmol/L MgCl2)2 μL、dNTPs(10mmol/L each)0.4μL、上下游引物(10 mmol/L)各 1μL、Taq酶(5 U/μL)0.4 μL/DNA模板 1μL,加 ddH2O至20μL,體系中含有 6%的 DMSO。循環參數:95℃2.5min;94℃35 s,56℃50 s,72℃2 min(ⅡPF6/Ⅱ PR6、A 3F/A7R引物對為 1 min),30個循環;72℃延伸 10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后,按通用方法[12]克隆到 pMD18-T載體上,重組質粒經 EcoRⅠ/HindⅢ酶切驗證后送上海英駿生物技術有限公司測序。利用 Vector NTI Suite 8分析獲得的 DNA序列,同時在 GenBank中進行 BLAST分析,并利用 MEGA 3.1對Ⅱ型 PKS基因進行進化樹分析。

表 1 用于 PKS/NRPS基因擴增的引物列表Table 1 Primer pairs for amplifying PKS/NRPS genes

2 結果和分析

2.1 抗菌活性

對所試金黃色葡萄球菌、蘇云金桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌,乙酸乙酯粗提物在 0.1 mg/mL的低濃度下均有明顯的抑菌圈產生,表明其對革蘭氏陽性細菌有較強的廣譜抑制作用;高濃度下對銅綠假單胞有抑制作用,而低濃度下對甘藍黑腐病菌也有明顯的抑制作用,這表明其對部分革蘭氏陰性菌也有不同程度的抑制作用(表 2)。

表 2 乙酸乙酯粗提物對測試菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of the inhibition zones of EtOAc extracts against testmicrobes

圖 1 TLC-生物顯影Fig.1 TLC-bioautography

TLC表明,粗提物存在兩個主要的藍色組分B1、B2,Rf值分別為 0.63、0.44;展層后的 TLC薄板與含金黃色葡萄球菌的瓊脂接觸5 min,平皿培養過夜即可在 B1、B2的相應位置顯示出兩個抑菌透明區,這表明 B1、B2是兩個主要的抗菌活性物質(圖1)。當 TLC薄板與瓊脂接觸時間延長至 30 min,培養后平皿上可出現一個超過平皿面積一半的大抑菌透明區;接觸過夜,抑菌透明區即超過平皿面積的3/4(結果未顯示),這也表明藍色組分 B1、B2對金黃色葡萄球菌有較強抑制作用。

2.2 抗腫瘤活性

終濃度為 2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL的乙酸乙酯粗提物在 48 h對 HeLa細胞的生長抑制率分別為 8.2%、23.5%、40.9%、52.7%、81.2%、96.7%,陽性對照 5-氟尿嘧啶(500μg/mL)的抑制率為 60.3%,這顯示粵藍鏈霉菌產生了具有極強抗腫瘤活性的代謝產物(圖 2)。

圖 2 乙酸乙酯粗提物對HeLa細胞的抑制作用Fig.2 Inhibtion effect of EtOAc extracts against HeLa cells

2.3 PKS/NRPS基因的克隆及分析

引物 K1F/M 6R可擴增 PKSI的酮酰合酶(ketosynthase)及甲基丙二酰 CoA轉移酶(methylmalonyl-CoA transferase)兩個功能域的部分基因序列。電泳檢測顯示,PCR產物在 1297 bp處有一主條帶,與預期大小相符(圖 3)。測序結果表明,該擴增片段(ks1)是典型的 PKSI基因序列 (登錄號:FJ908088);BLAST分析發現,其編碼的氨基酸序列與金鏈菌素 (Aureothin)、Kijanimicin、氯絲菌素(Chlorothricin)、殺念菌素(Candicidin)、南昌霉素(Nanchangmycin)等的 PKS相應區段有較高的同源率(表 3),提示該 PKS可能負責具有重要生物活性的大環內酯類抗生素的生物合成。

圖 3 PKS/NRPS基因 PCR電泳檢測Fig.3 Gelelectrophoresis of PCR products of PKS/NRPSgenes 1.DL5000;2.ks1;3.ks2;4.ks3;5.nrps

表 3 粵藍鏈霉菌PKSI與其它 PKSI的同源性比較Table 3 Homology alignment of the amp lified PKSI fragmentwith PKSI from other sources

引物ⅡPF6/ⅡPR6擴增的目標區域是 PKSⅡ酮酰合酶 α鏈 (KSα)羧基端基因序列,PCR產物電泳檢測顯示,在預期片段大小處有一主條帶(圖 3),測序結果表明,該擴增片段(ks2)613 bp(登錄號:EU709745),其編碼氨基酸序列與深藍鏈霉菌(S.cyaneus(S.curacoi))(X62518)、郝氏鏈霉菌(S.halstedii)(L05390)、天藍色鏈霉菌(S.coelicolor)A3(2)(X55942)孢子色素 PKS相應區域的同源率分別為 92%、91%、89%;在基于氨基酸序列的進化樹中,其與合成孢子色素的 PKS聚為一枝(圖 4a),推測該 PKS基因簇負責粵藍鏈霉菌孢子色素的合成。

KSa34F/ⅡPR6擴增的是 PKSⅡ基因簇中幾乎全長的 KSα基因序列,電泳檢測顯示,PCR產物存在目標條帶(圖 3),測序結果表明,該擴增片段(ks3)長 1188 bp(登錄號:FJ908089),其編碼氨基酸序列與醌那霉素(Kinamycin)(AY228175)、杰多霉素(Jadomycin)(DS570913)KSα有 94%的同源率。進化樹分析,其與角環類抗生素 PKS聚為一枝(圖 4b)。由于 PKSⅡ是迭代型(iterative)的,酮酰合酶參與了聚酮基本骨架合成的全過程,因此,可推測該序列所在基因簇可能負責角環類抗生素的生物合成。

引物 A3F/A7R擴增的目的片段是 NRPS腺苷酰化(adenylation,A)功能域的部分基因序列,PCR產物電泳檢測顯示,在約 650 bp處存在一條主帶(圖 3),測序結果表明,該擴增片段(nrps)638bp(登錄號:FJ908087);BLAST分析,序列僅與天藍色鏈霉菌 A3(2)(AL939113)、阿維鏈霉菌(S.avermitilis)MA-4680(BA000030)、灰色鏈霉菌灰亞種(S.griseus subsp.griseus)NBRC13350(AP009493)三個基因組測序的長鏈脂酰輔酶 A合成酶(long-chain acyl coA synthetase)基因有 90%～91%的同源率,這提示所獲得的序列并不是來自負責合成非核糖體多肽(NRP)的基因簇。

圖 4 基于PKSⅡ基因擴增區域編碼氨基酸序列的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of PCR-amplified regions of the PKSⅡgenes

3 討論

鏈霉菌是所有已知生物中產生次級代謝產物最為豐富的屬種之一。這些次級代謝產物化學結構多樣,不僅對產生菌本身有著重要的意義,而且對其它生物也具有廣泛的生理活性,也正因為如此,才使得鏈霉菌在現代醫藥中占有重要的地位。經過幾十年的篩選,發現新活性物質的幾率越來越低,篩選獲得新的菌種資源已成為關鍵因素。另一方面,鏈霉菌遺傳學的發展使得各種活性物質的產生機制被不斷闡明,PKS和 NRPS是活性物質產生的兩條主要途徑,目前已有數以百計的抗生素生物合成基因簇被克隆,基于此的組合生物合成(Combinatorial Biosynthesis)的興起,為新生物活性物質的獲得開辟了新途徑。

本研究對新近報道物種——粵藍鏈霉菌的次級代謝產物的生物活性進行了研究,發現乙酸乙酯粗提物對革蘭氏陽性細菌有較強的廣譜抗菌活性,對部分革蘭氏陰性菌也有不同程度的抑制作用,兩個藍色組分 B1、B2是主要的抗菌活性成分;粗提物對HeLa腫瘤細胞也有很強的抑制作用;同時對 PKS/NRPS相關基因進行了初步分析,獲得 PKS/NRPS基因相關序列 4條,其中 ks1、ks3與已知的負責重要抗生素生物合成的 PKS基因序列有較高的同源性,提示這兩條序列所代表的 PKS基因簇有可能是粵藍鏈霉菌產生次級代謝產物的重要途徑,這些新基因的發現也為組合生物合成提供了更多的基因資源。

在鏈霉菌中,有一些種能產生藍色素。早期的鏈霉菌分類系統甚至以藍色素作為分類的一個主要依據,將產藍色素的種歸為藍色類群(cyaneus group)。對初步純化的藍色組分 B1、B2進行1H、13C NMR分析,初步判斷可能為芳香聚酮類化合物,二者的譜峰非常相似,提示二者的主成份是同系物(數據未顯示)。在已知的藍色素中,粵藍鏈霉菌產生的藍色素與天藍色鏈霉菌產生的芳香聚酮類抗生素放線紫紅素(actinorhodin)[13]最為相似,都具有抗菌活性,能遇酸變紅、遇堿變藍,但二者在色調上并不相同(紫羅蘭:天藍色),將乙酸乙酯粗提物進行LC/ESI-MS分析,未發現含有與放線紫紅素或其已知同系物相同分子量的組分;利用放線紫紅素 PKS基因的特異性引物也不能擴增出目標基因(數據未顯示),這些結果提示,粵藍鏈霉菌產生的藍色素不同于放線紫紅素,其活性物質有可能是新的物質。目前進一步的分離純化和結構鑒定正在進行中。

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