產磷脂酶 C芽孢桿菌 Z-13產酶條件優化

詹逸舒,孫天瑋,陳 里,劉仁萍,吳永堯

湖南農業大學生物科學技術學院,長沙 410128

磷脂酶 C(phospholipase C,PLC)是一類可催化磷酯 C3上的磷酯酰鍵的脂類水解酶,在細胞代謝、信息傳遞和抗血小板功能等方面起著重要作用[1]。其作用底物為甘油磷脂和磷脂酰類,能特異性的水解質膜表面鞘磷脂(sphingomyelin,SM)的磷酸二酯鍵產生神經酰胺[2,3](ceramide)。神經酰胺作為生物信息傳遞的“第二信使”,具有調節神經細胞生長,誘導癌細胞程序性凋亡,以及對皮膚的特殊生物高效保濕功能[4]。國外已將其作為重要生理活性成分及醫藥原料,廣泛應用于在藥品、化妝品、美容食品等領域[5]。

目前國外主要從動植物原料中提取神經酰胺,植物源比動物源神經酰胺更為安全。神經酰胺在生物材料中含量非常低(萬分之一至十萬分之一),價格十分昂貴。我國魔芋(Konjac)資源十分豐富,占世界魔芋種數的 22.6%。其中含有豐富的神經酰胺(0.15% ～0.2%),是米糠和小麥中(0.01% ～0.02%)的 10倍[6],但其中的神經酰胺與磷酸膽堿結合以鞘磷脂形式存在于細胞膜中,而呈結合狀態的神經酰胺難以直接提取。為使可提取的游離神經酰胺含量提高,積極開發產生特殊活性的 PLC的菌株,具有十分重要的意義。作者對產磷脂酶 C芽孢桿菌 Z-13產酶條件進行了研究,目的在于優化產酶條件,提高產酶能力,為磷酯酶 C的開發利用及魔芋神經酰胺的提取打下基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養基

產磷脂酶 C芽孢桿菌 Z-13由本實驗室分離、篩選并保藏。

基礎培養基:蛋白胨 1.0%、牛肉膏 0.3%、NaCl 0.5%、pH 7.2～7.4,1×105 Pa滅菌 30min。

硼砂卵黃培養基:硼砂 0.19% 、硼酸 1.09%、NaCl 0.66% 、卵黃 10%,pH 7.2～7.4。

1.2 產磷脂酶 C菌 Z-13產酶條件的優化

1.2.1 培養基組成的確定

保持基礎培養基其它組成不變,依次改變培養基的氮源、碳源和無機鹽種類,等量接種 Z-13菌懸液,35℃、裝液量為 100mL/250m L、150 r/min搖床培養 12 h,測定發酵液中磷脂酶 C活性及生物量。

確定最佳氮源、碳源和無機鹽后,采用均勻設計試驗[7],利用 DPS v7.05專業版軟件的均勻試驗設計表,根據預試驗結果及試驗可行性確定考察因素的范圍,對篩選出的培養基組分進行優化,然后通過二次多項式逐步回歸分析實驗數據,建立回歸方程,通過指標最大預測值確定發酵培養基各組分的適合配比,并進行驗證試驗。

1.2.2 產酶培養條件的確定

采用優化后的培養基,分別從接種量、搖床轉速、培養基初始 pH值、培養溫度、培養時間等進行單因素試驗。

1.3 粗酶液制備

培養 12 h的發酵液用 60目紗布粗濾,8000 r/min離心 25min,收集上清液即為粗酶液,供酶活測定。

1.4 生物量測定

平板菌落計數法

1.5 酶活測定

卵黃瓊脂杯碟法[8,9]:取 20 g卵黃(新鮮的土雞蛋),加 80mL無菌水,搖勻,得到 20%的卵黃液,再制成硼砂卵黃瓊脂培養基。待培養基溶化后,倒入培養皿中冷卻凝固,其上平放牛津杯,吸取 100μL粗酶液于杯中,37℃條件下培養 24 h,根據磷脂酶C能水解卵黃瓊脂平板中卵磷脂產生乳白色的暈圈,用游標卡尺測定反應后生成的乳白色暈圈(沉淀圈)直徑,乳白色暈圈越大,PLC活性越大。

2 結果與討論

2.1 單因素法優化培養基組成

2.1.1 碳源

基礎培養基中分別添加濃度為 1.0%的不同碳源,它們對磷脂酶 C活力及生物量影響見表 1。從表中可以看出,可溶性淀粉和魔芋飛粉為碳源時菌Z-13產酶能力明顯優于牛肉膏、葡萄糖、蔗糖、麩皮、玉米粉,說明菌 Z-13利用可溶性淀粉和魔芋飛粉的能力優于其他幾種碳源。其中魔芋飛粉作為碳源時,對其產酶影響較大,乳白色沉淀圈直徑達到了23mm,生物量為 4.5×107CFU/mL,這可能是由于魔芋飛粉中含有的豐富淀粉和鞘磷脂化合物,及其它有利于其生長的營養成分,促進了其發酵產酶,因此選擇魔芋飛粉為碳源。

表 1 不同碳源對酶活和生物量的影響Table 1 Effect of different carbon sources on enzyme activity and biomass

2.1.2 氮源

在基礎培養基中分別添加濃度為 1.5%的不同氮源,它們對磷脂酶 C活力及生物量的影響見表 2。從圖中可以看出,酵母膏作氮源時發酵后產磷脂酶C活性最高,乳白色沉淀圈直徑達到了 24mm。這說明菌 Z-13利用酵母膏的能力優于其他幾種氮源。這可能與酵母粉含有的氨基酸、維生素等生長因子的配比更適合其的生長。其中黃豆粉作氮源時,乳白色沉淀圈直徑達到了 22mm,略低于酵母膏,但明顯高于其他 2種無機氮源,且生物量為 1.6×108CFU/mL,高于其他氮源。由于黃豆粉是發酵工業最常用的有機氮源,價格便宜,而且其中含有的豐富磷脂類化合物能誘導該菌種產酶,綜合考慮效果與原料成本,因此選擇黃豆粉為氮素營養。

表 2 不同氮源對酶活和生物量的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity and biomass

2.1.3 無機鹽

在基礎培養基中分別添加濃度為 0.2%的不同無機鹽,它們對磷脂酶 C活力及生物量的影響見表3。結果表明,Zn2SO4?7H2O和 K2HPO4?3H2O有利于菌種生長,對產酶有一定的促進作用,產生的乳白色沉淀圈直徑大于其他無機鹽,生物量也高于其他無機鹽。可能由于金屬離子中 Zn2+是酶的輔酶或激活劑[10];同時磷是氧化磷酸化反應的必需元素,K+能影響細胞膜的通透性,磷酸鹽既能促進菌體的基礎代謝,又影響許多代謝產物的生物合成,因此選用 Zn2SO4?7H2O和 K2HPO4?3H2O為無機鹽組合,添加到培養基中進行下一步優化試驗。

表3 不同無機鹽對酶活和生物量的影響Table 3 Effect of different inorganic salts on enzyme activity and biomass

2.2 均勻設計法優化培養基

培養基中各組分之間有一定的內在聯系,在單因素試驗的基礎上,考察培養基中碳源、氮源及無機鹽的含量對菌種生長及產磷脂酶 C的影響,以尋求培養基中各組分的最佳配比。對篩選出的 4種培養基組分進行了優化,采用 4因素 15水平 15組試驗的方式,每 1 L培養基內各因素水平為:魔芋飛粉和黃豆粉 0.0～35 g,各水平差為 2.5 g;K2HPO4?3H2O和 ZnSO4?7H2O 0.0～2.8 g,各水平差為 0.2 g。均勻設計表及試驗結果見表 4。

表 4 均勻設計試驗優化培養基方案和結果Table 4 The scheme and resultofmedium optimization by uniform design

采用 DPS v7.05專業版軟件,將表 4中各因素各水平對酶活的影響結果,進行二次多項式逐步回歸分析,最終得到如下方程:

y=13.06-2.59X1+3.92X2+23.03X3+21.42X4+0.39X21-0.50X22-4.52X23-84.94X2

4

相關系數 R=0.9282,檢驗值 F=4.6703,顯著水平 p=0.0382,剩余標準差 S=2.0874,調整后的相關系數 Ra=0.8229查表 F0.05(4,10)=3.48,F＞F0.05(4,10),顯著性水平檢驗通過,回歸方程顯著。

根據回歸方程對 y求最大值,當 x1=2.5 g/L,x2=30 g/L,x3=2.8 g/L,x4=1.3 g/L時,Ymax=27.75 mm,其預測區間為:Y=Ymax±Uα? S=27.75 ±4.09。

即以魔芋飛粉 2.5 g/L、黃豆粉 30 g/L、K2HPO4? 3H2O 2.8 g/L、Zn2SO4? 7H2O 1.3 g/L為優化培養基配方時,通過卵黃瓊脂杯碟法測得產生的乳白色暈圈(沉淀圈)直徑應該在 23.66～31.84 mm范圍內。根據優化條件,取魔芋飛粉 2.5 g/L、黃豆粉30 g/L、K2HPO4? 3H2O 2.8 g/L、Zn2SO4? 7H2O 1.3 g/L,進行 3次搖瓶實驗驗證,最終乳白色暈圈(沉淀圈)直徑的平均結果為 27mm,生物量為 5.7×108CFU/m L,實驗結果在預測的范圍內,且均有顯著性提高。

2.3 產酶條件確定

2.3.1 接種量優化

在相同培養條件前提下,分別按 0.1%、0.5%、1%、4%和 8%的接種量接種菌懸液(菌濃度 3×105 CFU/mL)于培養基中進行培養,它們對磷脂酶 C活力及生物量的影響見圖 1。結果表明,接種量為0.5%時,暈圈直徑為 26 mm,是 5個不同梯度接種量中暈圈最大的;接種量為 1.0%時生物量達到最大,暈圈直徑為 24.5mm,酶活下降不大。當接種量逐漸繼續增大時,酶活反而減小,這可能是由于隨接種量的增加,菌體繁殖過快、過稠,造成營養基質缺乏或溶氧不足而不利于菌體產 PLC。基于磷脂酶 C活力及生物量綜合考慮,選擇接種量為 1.0%的為該菌培養的合適接種量。

圖1 接種量對酶活和生物量的影響Fig.1 Effects of inoculation size on enzymeactivity and biomass

2.3.2 轉速優化

分別在搖床轉速為 60 r/min、100 r/min、150 r/min和 200 r/min的條件下進行搖瓶培養,搖床轉速與酶活及生物量的關系見圖 2。結果表明,在較低的轉速下,溶解氧濃度較低,所得到的生物量較小,發酵液的酶活力較低;轉速為 150 r/min時,乳白色暈圈直徑最大,且生物量也達到最大;搖床轉速在200～250 r/min之間,由于轉速過快,剪切力過大,不利于菌種生長,發酵產 PLC能力略有下降。基于提高溶氧,菌種的耐受力及節約能源方面的考慮,選擇搖床轉速150 r/min為該菌培養的合適搖床轉速。

圖 2 搖床轉速對酶活和生物量的影響Fig.2 Effects of rotating speed on enzyme activity and biomass

2.3.3 溫度優化

圖3 溫度對酶活和生物量的影響Fig.3 Effects of temperature on enzyme activity and biomass

溫度可通過影響發酵過程中酶反應速率、蛋白質性質及發酵液物理性質,進而影響發酵的動力學特性和產物的合成。分別按 25、28、32、35、40℃搖瓶培養,培養溫度與酶活及生物量的關系見圖 3。結果表明,在 25～36℃的溫度范圍內,菌體生物量隨溫度增加而不斷增加,同時酶活力也在 32℃左右達到最大;當溫度繼續升高,不利于菌 Z-13生長和PLC積累,生物量及酶活力均呈下降趨勢。因此,選擇溫度為 32℃為該菌合適的培養溫度。

圖 4 pH對酶活和生物量的影響Fig.4 Effects of pH on enzyme activity and biomass

2.3.4 初始 pH優化

分別按培養基初始 pH 5、6、7、8、9、10和 11搖瓶培養,培養基初始 pH與生物量及酶活的關系見圖 4。結果表明,當培養基初始 pH小于 10時,酶活隨 pH提高而增大,菌體生物量在 pH值為 8時達到最大,且 pH在 8～10范圍內,生物量變化不大;當pH值為 11時,酶活開始顯著下降,菌體生物量與產PLC酶活的培養基合適初始 pH都在堿性范圍內。基于菌種生長和 PLC的積累方面的考慮,選擇pH9.0為該菌發酵合適的初始培養基 pH。

2.3.5 培養時間優化

圖 5 培養時間對酶活和生物量的影響Fig.5 Effects of time on enzyme activity and biomass

微生物發酵終點的判斷,對提高產物的生產能力和經濟效益很重要的,因此確定一個合適的培養時間十分必要,培養時間與生物量及酶活的關系見圖 5。結果表明,隨著培養時間的延長,菌體的生長繁殖,酶活開始有明顯的上升,培養 15 h后,酶活達到最大值,18～21 h菌體達到對數生長期。隨著時間的推移,營養物質不斷減少,組成成分發生變化,菌體的生長繁殖速度下降;同時由于菌體釋放體內的分解酶及各種環境因子的改變抑制了酶的活性。因此,發酵培養時間不宜過長,最佳培養時間為15 h。

2.3.6 產酶條件優化前后 PLC酶活定性測定

利用磷脂酶 C可水解卵黃中的卵磷脂,在含有卵黃的瓊脂平板上產生乳白色暈圈的特點(如圖 6所示),可以根據酶樣品在卵黃平板上所產生的乳白色暈圈的大小來定性檢測菌種產磷脂酶 C酶活的高低。由于操作方便,原料豐富,廣泛的應用于磷脂酶 C菌種的篩選及磷脂酶 C的純化制備[11,12]。將菌 Z-13接種至產酶優化前后培養基中,分別在優化前后的條件進行培養,卵黃瓊脂杯碟法定性測定PLC酶活,結果如圖 6所示。結果表明,在原始條件下,菌 Z-13產磷脂酶 C產生的沉淀圈(乳白色暈圈)直徑為 22 mm,經過產酶條件優化后,菌 Z-13產磷脂酶 C產生的沉淀圈(乳白色暈圈)直徑為 30 mm,增加了 8mm,產磷脂酶 C活性顯著性提高。

圖 6 卵黃瓊脂杯碟法酶活定性檢測Fig.6 Qualitative detection ofenzyme activity by egg yolk cylinder platemethod

3 小結

目前國內還沒有商業化的工業用 PLC制劑生產,對于細菌產磷脂酶 C的產酶條件研究研究報道還較少。本文以生物量和酶活為主要指標,采用單因素優化方法結合均勻設計試驗,對芽孢桿菌菌 Z-13產磷脂酶 C(phospholipase C,PLC)條件進行了優化,確定產酶培養基的適宜碳源為魔芋飛粉、適宜氮源為黃豆粉,適宜無機鹽為磷酸氫二鉀和硫酸鋅,采用均勻優化試驗設計,確定培養基組成為魔芋飛粉2.5 g/L、黃豆粉 30 g/L、K2HPO4? 3H2O 2.8 g/L、Zn2SO4?7H2O 1.3 g/L;在培養條件為接種量為1.0%、搖床轉速為 150 r/min、培養溫度 30℃、初始pH值 9.0、培養 15 h,有利于菌 Z-13生長及產磷脂酶 C,活菌總數為 4.5×109CFU/m L,卵黃瓊脂杯碟法測定磷脂酶 C產生的沉淀圈(乳白色暈圈)直徑可達 30mm左右。本研究所獲得芽孢桿菌 Z-13的優化產酶條件,經逐級放大試驗,將有可能在解決魔芋鞘磷脂酶法水解產神經酰胺過程中提供生物催化劑,使可提取的游離神經酰胺含量提高,為磷酯酶 C的工業生物技術開發利用及魔芋神經酰胺的生物加工過程打下基礎。

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