苯丙氨酸衍生物的合成、18F標記及其生物學評價

彭 程,馬云川,蘇玉盛,賀 勇,許荊立,陳玉蓉,齊傳民

(1.北京宣武醫院PET中心,北京 100053;2.北京師范大學 化學學院,放射藥物化學教育部重點實驗室,北京 100875)

代謝顯像是分子核醫學研究領域最為成熟的技術之一,目前已廣泛應用于臨床診斷。其中最重要的代謝顯像劑為18F-脫氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG)[1]。18F-FDG 為評價化療效果提供了一種無創檢查方法[2]。氨基酸是人體必需的營養物質,同樣可用作代謝顯像劑,天然酪氨酸經過放射性標記后,輸送至腦,參與腦內蛋白質的合成,因此可作為腦顯像劑,如,2-18F-氟-L-酪氨酸[3]。國內外也有很多關于合成腦腫瘤代謝顯像劑2-(4-(2-氟乙氧基)酪氨酸(2-(4-(2-fluoroethoxy)tyrosine,18F-FET)的報道[4-7]。18F-FET是天然氨基酸的類似物,不參與蛋白質合成,腫瘤細胞對其吸收由L型氨基酸轉運系統調控[8]。4-18F-L-苯丙氨酸、3-18F-3-丙基酪氨酸和O-18F-丙基酪氨酸等[9-10]經過分子結構修飾后也可用于PET顯像研究。而芳香脂肪酸作為一類潛在的正電子腫瘤顯像劑已經有了許多研究[11-14]。本研究擬將4-(2-羥基乙氧基)苯甲酸引入苯丙氨酸后進行18F標記,并觀察其在荷S180瘤昆明小鼠體內的生物分布,初步探討其PET顯像劑的可能性。

1 實驗材料

1.1 主要儀器及試劑

Bruker-400 MHz-Advance核磁共振儀:德國Brucker公司;WIZARD 1470型γ計數器:美國PE公司;Alltech高效液相分析儀、RM-905a放射性活度計:中國計量科學研究院;儲磷屏分析系統(Perkin Elmer Storage Phosphor System Cyclone Plus):美國 Perkin Elmer公司;LEICACM190型冷凍切片機:美國 Waters公司;Nicolet 360型紅外光譜儀:美國Nicolet公司;HP1100 HPLC-MSD型質譜儀:美國惠普公司;Pekin-Elemer 240-C元素分析儀、Grace Alltech高效液相色譜分析柱(5μm,250 mm×4.6 mm):美國Perkin Elmer公司。

1.2 動物模型

昆明小鼠:80只,清潔級,體重18～20 g,北京大學動物部提供;S180瘤細胞:北京大學動物部。在小鼠左前肢注射約0.2 mL 5.0×105個S180瘤細胞,7～10 d后,瘤體體積長至0.5～1 cm3時進行動物實驗。

2 實驗方法

2.1 4-(2-氟乙氧基)苯甲酰基苯丙氨酸甲酯,MFBPA)的合成與18F標記

2.1.1 MFBPA的合成

MFBPA的合成路線示于圖1。

圖1 MFBPA的合成路線

將 0.182 g 4-(2-羥基乙氧基)苯甲酸(1 mmol)與0.269 g苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽溶于二氯甲烷中,冰浴下,加入0.206 g二環己基酰亞胺(1 mmol),0.135 g HOBT(1 mmol),攪拌反應0.5 h。恢復到室溫反應,繼續攪拌過夜。薄層硅膠色譜(TLC)監測反應。反應完全后,抽濾掉反應液中的沉淀物,真空低溫旋蒸去溶劑,柱層析分離提純,得到白色固體為N-(4-(2-羥基乙氧基)苯甲酰基)苯丙氨酸甲酯(FBPA)[15]。將0.497 g FBPA(1 mmol)、0.380 g對甲苯磺酰氯(2 mmol)、0.024 g 4-二甲氨基吡啶(0.2 mmol)和0.101 g三乙胺(1 mmol)加入冰浴下的無水二氯甲烷溶液中,攪拌反應4 h,柱層析分離提純,即得N-4-(2-氟乙氧基)苯甲酰基苯丙氨酸(MFBPA,O)。采用1H NMR、13C NMR和MS對FBPA進行結構鑒定。

2.1.2 MFBPA的18F標記

MFBPA的18F標記反應示于圖2。

圖2 MFBPA的18 F標記反應

3 mg K2CO3(0.022 mmol)和15 mg K222淋洗QMA柱得到的K18F/K 222混合水溶液,在氮氣保護下,油浴加熱到120℃,加入0.5 mL乙腈,共加入3次,共沸除去反應體系中的少量水分,加入5 mg MFBPA(0.01 mmol),在80 ℃乙腈溶液中反應20 min。使用0.22μm過濾頭過濾后,使用半制備型HPLC進行分離提純。收集到的標記產品除去溶劑,滅菌處理后用生理鹽水稀釋備用。HPLC分析放化純度,洗脫條件:V(乙腈)∶V(水)=70∶30,流速:1 mL/min。采用1H NMR、13C NMR,MS對18F-MFBPA 進行結構鑒定。

2.2 18F-FBPA的合成

18F-FBPA的合成的合成路線示于圖3。

圖3 18 F-FBPA合成路線

18F-MFBPA在含10 mg LiOH(0.42 mmol)的V(甲醇)∶V(水)=10∶1甲醇水溶液中,90℃反應5 min后,恢復至室溫,加入1 mol/L HCl(0.24 mL)調反應液p H至7,得到18F-FBPA溶液。HPLC分析其放化純度。真空低溫旋去溶劑,用生理鹽水稀釋,備用。采用1H NMR,13C NMR,MS對18F-MFBPA進行結構鑒定。

2.3 脂水分配系數

分別取0.1 mL,p H 7.418F-MFBPA和18FFBPA的PBS溶液,加入1.9 mL PBS溶液和2 mL正辛醇,充分振蕩混合,離心,靜置,取水相和有機相各0.1 mL,測定其放射性計數,計算脂水分配系數。

2.4 18 F-MFBPA和18F-FBPA的體外穩定性

取少量18F-MFBPA和18F-FBPA分別與生理鹽水和96%的乙醇溶液混合,室溫靜置,分別于1 h和2 h取少量18F-MFBPA和18F-FBPA分別與乙腈和DMF溶液混合,60℃溫浴30 min,用HPLC檢測其放化純度。

取少量標記樣品溶液混合在小鼠血清中,37℃下溫育1 h和2 h,取部分溶液經Sep-Pak C18固相萃取柱,2 mL乙腈洗滌,合并淋洗液,用HPLC檢測其放化純度。

2.5 18 F-MFBPA和18F-FBPA的體內穩定性

分別隨機選取5只荷S180瘤昆明小鼠,經尾靜脈注射1.85 MBq18F-MFBPA或18F-FBPA,注射后60 min斷頸處死。分別取血和尿液樣本,血液樣本立刻以13 200 r/min離心5 min,然后加入0.8 mL PBS(10 mmol,p H 7.4),0.16 mL甲醇,0.04 mL氯仿洗滌。相同條件下再次離心,每個樣品兩次離心液合并后過Sep-Pak C18固相萃取柱。尿液樣本直接用1 mL PBS稀釋后過Sep-Pak C18固相萃取柱。用2 mL水和2 mL乙腈(1%TFA)分別洗滌。真空低溫旋去溶劑后,再用1 mL PBS溶解,HPLC檢測其放化純度,分析標記產物在體內的穩定性。

2.6 18 F-MFBPA、18 F-FBPA、18 F-FDG 和18 FFET在荷S180瘤鼠體內的生物分布

將20只荷S180瘤昆明小鼠,隨機分為4組,每組5只。分別經尾靜脈注射0.1 mL(0.296～0.37 MBq)18F-MFBPA 和18F-FBPA,0.1 mL(0.37 MBq)18F-FDG 和18F-FET,并于注藥后5、30、60、120 min分別將各組小鼠斷頸處死 ,迅速解剖取出心 、肝 、脾、肺 、腎 、胃 、大腸 、小腸 、肌肉 、血液 、腦 、腫瘤等組織,稱濕重,用 γ計數器測量計數,計算各臟器的放射性攝取率(%ID·g-1)以及腫瘤與肌肉、腫瘤與血、腫瘤與腦的放射性攝取比(T/NT)。

3 結果與討論

3.1 結構鑒定

3.1.1 FBPA的結構鑒定

IR(KBr,cm-1):ν3 340,1 741,1 626,1 605,1 497,1 357,1 261,1 172,1 220,1 017,936,765;1H NMR(CDCl3,500 MHz):δ7.83(d,2H,J=8.1 Hz,Ar-H),7.67(d,2H,J=8.5 Hz,Ar-H),7.36(d,1H,J=7.9 Hz,Ar-H),7.31(t,2H,J=7.1 Hz,Ar-H),7.29(d,2H,J=5.7 Hz,Ar-H),7.14(d,2H,J=7.0 Hz,Ar-H),6.80(d,2H,J=8.6 Hz,Ar-H),6.48(d,1H,J=7.3 Hz,NH),5.09(m,1H,J=5.8 Hz,CHCOOCH 3),4.40(t,2H,J=4.5 Hz,CH2CH 2OTs),4.20(t,2H,J=4.7 Hz,CH2CH2OTs),3.78(s,3H,COOCH3),3.27(dq,2H,J=5.7 Hz,CH 2Ph),3.01(s,3H,Ts-CH 3);13C NMR(CDCl3,125 MHz)δ:172.17,166,11,150.77,145.08,135.92,129.91,129.35,128.88,128.63,128.01,127.19,126.89,114.34,67.83,65.52,53.49,52.42,37.96,21.67;Anal.calcd for C26 H27 NO7 S:C,62.76;H,5.47;N,2.82;Found:C,62.84;H,5.78;N,2.95。該結果表明,所合成化合物為目標產物。

3.1.218F-MFBPA的結構鑒定

IR(KBr,cm-1):ν3 333,1 741,1 626,1 605,1 538,1 504,1 257,1 224,1 176,1 068,839;1H NMR(CDCl3,500 MHz):δ 7.73(d,2H,J=8.7 Hz,Ar-H),7.31(d,2H,J=7.3,Ar-H),7.29(d,2H,J=7.3,Ar-H),7.26(d,2H,J=7.3,Ar-H),7.15(d,2H,J=7.1 Hz,Ar-H),6.96(d,2H,J=8.7 Hz,Ar-H),6.53(d,1H,J=7.3 Hz,NH),5.10(q,1H,J=5.6 Hz,—CHCH 2Ph),4.84～4.75(dt,2H,2J HF=47.3 Hz,—CH2CH2F),4.30～4.24(dt,2H,3J HF=27.7 Hz,CH2CH2F),3.79(s,3H,COOCH 3),3.27(dq,2H,J=5.8 Hz,—CH 2Ph);19F NMR(CDCl3,400 MHz):-224.167(J=27.7 Hz,CH2CH2F),-224.292(J=47.4 Hz,CH2CH2F);13CNMR(CDCl3,125 MHz)δ:172.19,166.20,161.23,135.93,129.36,128.95,128.63,127.19,126.79,114.43,82.36,81.01,53.49,52.40,37.97;MS-EI:m/z=345.14(found:345.13);Anal.calcd for C19H20FNO4:C 66.08,H 5.84,N 4.06;found:C 65.90,H 5.64,N 4.07。該結果表明,所合成化合物為目標產物。

3.1.318F-FBPA的結構鑒定

IR(KBr,cm-1):ν3 547,3 387,3 242,1 746,1 626,1 608,1 510,1 007,927;1H NMR(DMSO-D6,500 MHz):δ8.58(d,1H,J=8.0,NH),7.79(d,2H,J=8.7,Ar-H),7.31(d,2H,J=7.3,Ar-H),7.26(t,2H,J=7.5 Hz,Ar-H),7.17(t,1H,J=7.0 Hz,Ar-H),7.02(d,2H,J=8.5 Hz,Ar-H),4.81～4.70(d-t,2H,J=47.8,3.6 Hz,CH2CH2F),4.33～4.25(d-t,2H,J=30.2,3.6 Hz,CH2CH2F),4.58(m,1H,J=8.65,4.3 Hz,CH),3.16(dq,2H,J=4.3 Hz,—CH2 Ph);13C NMR(DMSO-D6,125 MHz)δ:173.26,165.77,160.51,138.15,129.19,128.97,128.12,126.37,126.29,113.93,82.81,81.16,67.24,67.05,54.12,36.21;MS-EI:m/z=241.08(found:241.13)。該結果表明,所合成化合物為目標產物。

3.2 18 F-MFBPA和18 F-FBPA的標記率和放化純度

18F-MFBPA的標記率為23%～41%。18FMFBPA和18F-FBPA經HPLC分析放化純度均＞99%。18F-MFBPA和18F-FBPA與19F標準對照品通過 HPLC分析檢測,對應化合物保留時間相同,高效液相分離提取的標記化合物均為目標物。

3.3 18F-MFBPA和18F-FBPA的穩定性

經過HPLC分析,18F-MFBPA在血清中和體內代謝測試中水解為18F-FBPA,體外穩定性良好,2 h內沒有脫氟或分解現象。18F-FBPA體內外均顯示良好穩定性。

3.4 脂水分配系數

經過測定計算后,18F-MFBPA和18F-FBPA的脂水分配系數分別為0.94和-0.58。

3.5 生物分布

18F-MFBPA 、18F-FBPA 、18F-FDG 和18FFET在荷S180瘤鼠體內的生物分布及 T/NT分別列于表1～表8。

分析表1和表 3可知,18F-MFBPA和18FFBPA在各臟器組織中均有較高的初始放射性攝取。5 min時,18F-MFBPA在肝、腎的放射性攝取分別為 2.97±0.70%ID/g和 4.89±0.78%ID/g,而18F-FBPA 為11.45±1.05%ID/g和6.90±0.84%ID/g;60 min時,18F-MFBPA在肝、腎內的代謝率分別為83%和89%,18F-FBPA為95%和83%。18F-MFBPA和18FFBPA在肝和腎中的清除速度較快的。在腫瘤中的吸收代謝相對比較緩慢。比較18F-MFBPA和18F-FBPA發現,作為羧酸的18F-FBPA更容易在血液中清除。至120 min時,18F-FBPA依然在大腸、小腸的吸收值較高。經過多次平行試驗,結果表明,該標記化合物在腸內的代謝速度也很慢,具體原因正在研究中。

表1 18 F-M FBPA在荷S180瘤鼠體內的生物分布n=5)

表1 18 F-M FBPA在荷S180瘤鼠體內的生物分布n=5)

器官不同時間的放射性攝取率(%ID·g-1)5 min 30 min 60 min 120 min心 1.44±0.37 0.75±0.12 0.66±0.10 0.72±0.13肝 2.97±0.70 0.86±0.13 0.49±0.04 0.50±0.11脾 0.91±0.23 0.55±0.07 0.44±0.08 0.48±0.05肺 2.19±0.66 0.70±0.14 0.54±0.05 0.64±0.20腎 4.89±0.78 1.51±0.14 0.56±0.05 0.39±0.03胃 0.58±0.18 1.32±0.28 0.59±0.44 0.68±0.35大腸 1.03±0.31 1.05±0.28 0.73±0.33 0.69±0.13小腸 1.66±1.25 0.66±0.23 0.66±0.16 0.79±0.05肌肉 0.89±0.08 0.71±0.03 0.72±0.04 0.73±0.05血 1.56±0.25 0.86±0.06 0.66±0.07 0.66±0.22腦 0.85±0.15 0.40±0.02 0.38±0.03 0.37±0.02腫瘤 0.90±0.08 0.96±0.09 0.78±0.02 1.09±0.03

表2 18 F-MFBPA在荷S180瘤鼠體各時間點腫瘤與主要臟器的T/NT,n=5)

表2 18 F-MFBPA在荷S180瘤鼠體各時間點腫瘤與主要臟器的T/NT,n=5)

時間/min T/NT腫瘤與血 腫瘤與肌肉 腫瘤與腦5 0.57 1.01 1.06 30 1.11 1.35 2.40 60 1.18 1.08 2.05 120 1.65 1.49 2.95

表3 18 F-FBPA在荷S180瘤鼠體內的生物分布,n=5)

表3 18 F-FBPA在荷S180瘤鼠體內的生物分布,n=5)

器官不同時間的放射性攝取率(%ID·g-1)5 min 30 min 60 min 120 min心 3.30±0.10 0.82±0.21 0.80±0.04 0.77±0.09肝 11.45±1.05 1.32±0.47 0.50±0.03 0.47±0.05脾 1.54±0.01 0.66±0.11 0.54±0.10 0.50±0.05肺 4.01±0.44 0.91±0.31 0.60±0.05 0.59±0.06腎 6.90±0.84 4.54±0.92 1.13±0.16 0.52±0.03胃 1.34±0.07 1.93±0.05 1.28±0.31 0.62±0.06大腸 2.05±0.12 2.06±0.51 1.15±0.25 1.18±0.19小腸 8.53±0.34 1.26±0.37 1.18±0.22 1.25±0.15肌肉 1.73±0.02 1.14±0.09 0.64±0.06 0.33±0.08血 6.46±0.03 1.07±0.17 0.65±0.04 0.56±0.03腦 0.39±0.06 0.29±0.03 0.34±0.01 0.35±0.01腫瘤 1.63±0.07 1.42±0.03 0.95±0.05 0.70±0.02

表4 18 F-FBPA在荷S180瘤鼠體各時間點腫瘤與主要臟器的T/NT,n=5)

表4 18 F-FBPA在荷S180瘤鼠體各時間點腫瘤與主要臟器的T/NT,n=5)

時間/min T/NT腫瘤與血 腫瘤與肌肉 腫瘤與腦5 0.25 0.94 4.18 30 1.33 1.25 4.89 60 1.46 1.48 2.79 120 1.25 2.12 2.01

表5 18 F-FDG在荷S180瘤鼠體內的生物分布(,n=5)

表5 18 F-FDG在荷S180瘤鼠體內的生物分布(,n=5)

器官不同時間(min)的放射性攝取率(%ID·g-1)5 30 60 120心 2.06±0.06 2.69±0.14 3.24±0.20 6.27±0.30肝 1.35±0.42 0.23±0.01 0.22±0.04 0.20±0.03脾 1.31±0.40 0.90±0.19 0.83±0.04 0.46±0.03肺 1.52±0.66 0.64±0.05 0.57±0.06 0.52±0.11腎 2.16±0.35 0.61±0.23 0.54±0.15 0.25±0.06肌肉 1.56±0.13 1.07±0.16 0.97±0.06 0.78±0.06血 1.09±0.24 0.16±0.01 0.11±0.05 0.11±0.13腦 2.40±0.28 3.07±0.11 2.11±0.17 1.28±0.08腫瘤 1.27±0.24 1.86±1.18 2.16±0.34 1.70±0.06

表6 18 F-FDG在荷 S180瘤鼠體內各時間點腫瘤與主要臟器的T/NT,n=5)

表6 18 F-FDG在荷 S180瘤鼠體內各時間點腫瘤與主要臟器的T/NT,n=5)

時間/min T/NT腫瘤與血 腫瘤與肌肉 腫瘤與腦5 1.17 0.81 0.53 30 11.38 1.75 0.61 60 19.47 2.23 1.02 120 15.85 2.20 1.33

由表5可見,18F-FDG在腫瘤的攝取隨時間而升高,在60 min時,其腫瘤吸收攝取值達到2.16±0.34%ID/g。由表6可以看出,18F-FDG顯示出較好的腫瘤與血和腫瘤與肌肉的T/NT,分別為2.23和19.47。與表3比較可見,與18FFDG吸收趨勢不同,18F-FBPA在小鼠體內迅速被吸收,初始組織生物分布較高,隨時間逐步清除。18F-FDG作為葡萄糖類的代謝顯像劑具有多個羥基結構,在惡性腫瘤細胞中的攝取逐漸積聚。而18F-FBPA雖然沒有18F-FDG的吸收攝取結果明顯,但迅速的初始體內分布,使其具有良好的相對吸收時相點,因此,本工作選擇靜脈注射60 min作為顯像的最佳時間。

比較表7和表3可知,18F-FET相對18FFBPA在腫瘤有較高的吸收,在體內的各個組織中的代謝比較緩慢,血液的清除速率較低。在60 min時,18F-FET在荷瘤鼠模型中腫瘤與肌肉和腫瘤與血的 T/NT分別為1.23和1.10。18F-FBPA腫瘤與肌肉和腫瘤與血的 T/NT分別為1.48和1.46。

表7 18 F-FET在荷S180瘤鼠體內的生物分布(,n=5)

表7 18 F-FET在荷S180瘤鼠體內的生物分布(,n=5)

器官 不同時間(min)的放射性攝取率(%ID·g-1)5 30 60 120心 5.89±0.23 3.27±0.37 3.14±0.265 0.94±0.36肝 7.67±1.34 4.23±0.28 3.56±0.29 1.22±0.51脾 3.34±0.51 1.16±0.61 1.37±0.34 1.21±0.37肺 16.80±2.98 8.57±0.63 4.70±0.41 1.55±0.73腎 6.58±0.84 2.38±0.43 3.75±0.49 1.29±0.21肌肉 2.88±0.33 2.69±0.16 2.37±0.38 2.10±0.33血 6.81±0.95 3.23±0.33 2.51±0.36 1.12±0.21腦 0.99±0.24 1.29±0.09 0.94±0.23 0.73±0.21腫瘤 2.08±0.49 3.28±0.69 2.75±0.36 2.15±0.36

表8 18 F-FET在荷 S180瘤鼠體各時間點腫瘤與主要臟器的T/NT(,n=5)

表8 18 F-FET在荷 S180瘤鼠體各時間點腫瘤與主要臟器的T/NT(,n=5)

時間/min T/NT腫瘤與血 腫瘤與肌肉 腫瘤與腦5 0.31 0.72 2.10 30 1.02 0.62 2.54 60 1.10 1.23 2.93 120 1.92 1.40 2.95

18F-FDG和18F-FET的比較分析顯示,雖然18F-FBPA在腫瘤組織中的攝取沒有18F-FDG和18F-FET明顯,但因其良好的初始攝取、清除速率快以及穩定性較好等優點,值得進一步研究。

4 結 論

本研究合成了MFBPA并標記得到18FMFBPA及其水解產物18F-FBPA,對其性質進行了初步的研究,其中18F-FBPA放化純度高,穩定性好,在腫瘤組織中有明顯攝取。與目前臨床常用顯像劑18F-FDG、18F-FET的荷瘤鼠生物分布比較,結果顯示,18F-FBPA有進一步研究的價值。18F-FBPA在結構優化、轉運機制、藥代動力學以及PET顯像等方面評價研究正在進行中。

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