PEG脅迫對尖葉胡枝子幼苗SOD和POD同工酶的影響

馬彥軍,曹致中,李 毅

(1.甘肅農業大學草業學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農業大學林學院,甘肅蘭州 730070)

尖葉胡枝子(Lespedeza hedysaroides)為草本狀半灌木,具有防風固沙,抗寒、耐旱、耐貧瘠等特性,是較好的水土保持植物,又因其適口性好[1-3],粗蛋白質和粗脂肪含量高,返青早、枯黃晚、綠期長等優點[4],可作為改良干旱、半干旱退化草地和建植人工草地的優良牧草,被廣泛應用于我國草地生態建設和城鄉綠化美化中[5,6]。水分脅迫是植物生長發育過程中最易遭受到的生態脅迫因子[7],它對植物形態、光合作用、呼吸作用、物質運輸與合成等均會產生深刻的影響[8]。同時,植物也會通過一些生理生化反應來適應水分脅迫生境,如適度干旱脅迫時,植物體內有關代謝酶活性升高,細胞膜系統的抗氧化能力增加,可以消除植物體內的過氧化氫(H2O2)和超氧陰離子自由基(O2-)等活性氧對細胞膜系統的損傷,從而提高植物的抗逆性[9]。目前,對胡枝子屬植物的栽培及生態生物學的研究報道較多[10],而其抗旱性研究報道較少[11-13]。為此,以尖葉胡枝子幼苗為對象,研究PEG模擬干旱脅迫對其幼苗超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)同工酶、酶含量以及酶活性的影響,初步揭示其抗旱機理,了尖葉胡枝子抗旱性研究,合理開發利用及育種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為2006年在平涼靈臺收集的尖葉胡枝子種子。

1.1.1 種子預處理 將供試種子用75%的酒精消毒1～2 min后,用無菌水沖洗干凈,在100℃水中浸泡5 min后,用自來水沖洗冷卻降溫,放置24 h后剔除未吸脹種子,備用。

1.1.2 PEG處理 將經過預處理的種子置于120 mm培養皿內浸透了不同濃度PEG(質量濃度分別為50 g/L,100 g/L和150g/L)溶液的濾紙上發芽,每天向濾紙加PEG溶液數滴,以浸透濾紙并稍有剩余,每2 d換1次濾紙,以盡量減少水勢變動。對照(CK)以蒸餾水代替PEG。每個濃度梯度(包括對照)3次重復,每個重復100粒種子。室溫下發芽,待苗高達到5 cm時,取葉片進行SOD和POD同工酶電泳。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗酶液的制備 分別稱取不同PEG濃度處理的尖葉胡枝子葉片0.5 g,加入2 mL 50 mmol/L pH 7.8的磷酸緩沖液(PBS內含2 mmol/L EDTA-Na2,1%聚乙烯吡咯烷酮)冰浴研磨成勻漿,勻漿于13 000 rpm,4℃離心20 min,上清液即為粗酶提取液。

1.2.2 電泳 采用不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離膠濃度7%(以丙烯酰胺濃度計),濃縮膠濃度為3%(以丙烯酰胺濃度計),點樣量20μ L,在 80～100 V 穩壓條件下電泳3～4 h。

POD染色采用聯苯胺染色法。待酶帶顯出,立即放入自來水沖洗,酶帶全變成棕色,在GDS-8000凝膠成像系統上拍照;

SOD染色采用氮藍四唑(NBT)法。用4000×光照25～30 min SOD的活性譜帶表現為藍色背景上的無色透明區帶,在GDS-8000凝膠成像系統上拍照。

結果采用國際認證的Pharmacia Biotech公司的電泳圖譜分析軟件ImageMaster 1D(Version 2.0)進行譜帶分析。

SOD和POD活性單位采用GDS-8000凝膠成像系統掃描的灰度值表示。

2 結果與分析

2.1 不同濃度PEG脅迫對尖葉胡枝子幼苗葉片SOD和POD同工酶的影響

結果顯示(表1),尖葉胡枝子幼苗葉片在不同濃度PEG脅迫,SOD和POD同工酶譜帶數目沒有變化,無新酶帶的出現或酶帶的減少,分別為酶帶SOD1-4和POD1-3。

表1 PEG脅迫尖葉胡枝子幼苗葉片S OD和POD同工酶遷移率Table 1 Mobility rate of S OD and POD isozyme in the seedling of Lespedeza hedysaroides

由表1可以看出,不同濃度PEG處理,尖葉胡枝子幼苗葉片4種SOD同工酶的遷移率大小不一。SOD1和SOD2在100 g/L和150 g/L PEG處理下遷移率一致,分別為0.04和0.44,在50 g/L PEG處理下分別為0.05和0.43,對照分別為0.03和 0.42;SOD3在50 g/L,100 g/L和150 g/L PEG處理下,遷移率一致為0.62,對照為0.61;SOD4在100 g/L和150 g/L PEG處理下遷移率一致,為0.94。在50 g/L PEG處理下和對照的遷移率一致,為0.93。在對照和50 g/L PEG處理下,各同工酶的遷移率不一致,而在100 g/L和150 g/L處理下,各SOD同工酶的遷移率一致。

不同濃度PEG處理,尖葉胡枝子幼苗葉片3種POD同工酶的遷移率大小不一。POD1在50 g/L,100 g/L和150 g/L PEG處理下遷移率均為0.01,對照為0.02;POD2在對照、50 g/L,100 g/L和150 g/L PEG 處理,遷移率分別 0.11、0.12、0.10和 0.11;POD3對照和各處理下遷移率一致均為0.050(表1)。遷移率的不同,說明SOD和POD同工酶分子量大小不同。由遷移率可以看出,尖葉胡枝子幼苗葉片在不同濃度PEG處理下,共有10種SOD同工酶基和6種POD同工酶基因表達。

2.2 不同濃度PEG脅迫對尖葉胡枝子幼苗葉片SOD和POD同工酶酶量及活性的影響

SOD和POD是細胞抵御活性氧傷害的膜保護系統,在清除超氧自由基、過氧化氫和過氧化物及阻止或減少羥基自由基形成方面起重要作用。在水分脅迫下,植物細胞自由基產生和清除的平衡遭到破壞,過剩的自由基會傷害細胞膜系統,因此,SOD、POD的活性與植物的耐旱能力密切相關,其高低可以反映植物對干旱逆境抵御能力的大小。尖葉胡枝子幼苗葉片在50和100 g/L PEG濃度處理以及對照下,SOD和POD同工酶及總酶酶量逐漸在增加,其中,POD3在0～50 g/L PEG處理下,酶量下降,50～100 g/L PEG處理下,酶量增加。100～150 g/L SOD和POD同工酶及總酶量逐漸在降低(圖1)。隨著PEG脅迫程度的加深,尖葉胡枝子幼苗葉片SOD和POD活性均呈現先增大后減少的趨勢。低脅迫水平使SOD和POD活性增加,高脅迫水平使SOD和POD活性降低。酶量和酶活性之間呈正相關,酶量增加酶活性增大,酶量減少,酶活性下降。

圖1 PEG處理下尖葉胡枝子幼苗葉片SOD(左)和 POD(右)同工酶酶量的變化Fig.1 Effect of PEG on S OD and POD isozyme concentration in the seedling of Lespedeza hedysaroides

圖2 PEG處理下尖葉胡枝子幼苗葉片 S OD(左)和POD(右)同工酶酶活性的變化Fig.2 Effect of PEG on S OD and POD isozyme activity in the seedling of Lespedeza hedysaroides

3 結論與討論

SOD,CAT和POD是生物體內的保護性酶,在清除生物自由基上擔負著重要功能,SOD能將O2-轉化為H2O2,而CAT和POD可將H2O2進一步清除產生H2O,三者協同作用可使自由基維持在一個較低水平,從而避免膜傷害,達到保護細胞的目的。王娟等[14]報道,植物在水分脅迫初期SOD,CAT和POD活性升高,但隨著水分脅迫時間延長和強度增加,SOD,CAT及POD活性則不同程度下降,與此次實驗結果一致。實驗表明,PEG濃度在50～100 g/L時,SOD和POD酶活性增加,PEG濃度為150 g/L,SOD和POD酶活性下降。說明適度水分脅迫能增強植物對干旱的適應性,同時這兩種酶活性的協調變化,也顯示了植物生理過程變化的協調性。

研究表明,同工酶與作物抗旱性有一定的聯系[15],尖葉胡枝子幼苗水分脅迫后,葉片SOD、POD同工酶未出現新的酶帶,但酶譜遷移率大小不同,說明在不同脅迫下出現了不同酶的基因表達。共有10種SOD同工酶和6種POD同工酶基因表達。

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