甲酸混合酸脫鈣液在兔股骨頭制片中的應用*

周正麗，湯華軍，王 云(瀘州醫學院人體解剖學教研室，四川瀘州 646000)

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甲酸混合酸脫鈣液在兔股骨頭制片中的應用*

周正麗，湯華軍，王 云(瀘州醫學院人體解剖學教研室，四川瀘州 646000)

目的 觀察甲酸混合酸脫鈣液對股骨頭組織的制片效果。方法 采用成年新西蘭大白兔10只，切斷股骨頭圓韌帶，取股骨上1/3段置于甲酸混合酸脫鈣液中脫鈣1周，隨即常規脫水、透明、石蠟包埋，制備5 μm厚縱切片，行HE染色。結果 所有組織切片厚薄均勻，未見脫片現象，股骨頭完整性較好，各層次分明，骨小梁結構完整，軟骨細胞、骨細胞細胞形態清晰，著色鮮艷。結論 選用甲酸混合酸脫鈣液制片股骨頭組織具有脫鈣時間相對較短、操作簡單、組織結構完整、染色效果較好的特點。

股骨頭； 兔； 脫鈣

股骨頭壞死是骨關節外科常見難疾，動物模型實驗研究是當前股骨頭壞死研究的熱點之一[1-2]，通過組織病理切片評估股骨頭病變的進程是股骨頭壞死檢查的金標準，而股骨頭組織由于其硬度較大，易脫片、易破碎、染色不佳等常使制片效果不盡如人意，其中脫鈣液的選擇是影響制片效果的關鍵。故本文選擇股骨頭壞死常備實驗動物--經濟實用性健康兔為制片對象，擬采用甲酸混合酸脫鈣液制作切片以觀察其制片效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年新西蘭大白兔10只，雌雄不拘，體質量2.0～2.5 kg，由瀘州醫學院實驗動物中心提供，本研究所采用的動物實驗操作程序符合動物實驗相關倫理要求。

1.2 主要試劑與儀器 試劑包括生理鹽水、戊巴比妥鈉、甲酸、濃鹽酸、三氯化鋁、甲醛、石蠟、蘇木精染液、伊紅染液、甘油、二甲苯等。實驗儀器磁力攪拌器(上海躍進醫療器械廠)，熱恒溫電烤箱(上海躍進醫療器械廠)，RM 2235石蠟切片機(Leica)，YS100光學顯微鏡(Nikon)，電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 取材 以3%戊巴比妥鈉 30 mg/kg劑量耳緣靜脈注射麻醉動物；依次切開皮膚、淺筋膜，鈍性分離各層臀肌，切開髖關節囊，切斷股骨頭韌帶，顯露股骨頭，選擇骨干1/3處將股骨鋸斷，在低溫冰塊上迅速剔除股骨附著的肌肉及結締組織，將其置于10%甲醛中固定48 h。

1.3.2 甲酸混合酸脫鈣液的配置 取甲酸5 mL，濃鹽酸8.5 mL，稱量三氯化鋁7 g，混勻后加蒸餾水定容至100 mL，現配現用。

1.3.3 股骨頭組織切片的制作 將標本置于甲酸混合酸脫鈣液中，磁力攪拌器攪拌混勻，靜置脫鈣1周，之后以大轉子為中心，縱行剖開股骨頭，常規脫水、透明，隨即石蠟包埋，采用石蠟切片機制備5 μm厚縱切片，行HE染色。

2 結 果

所有組織切片厚薄均勻，無刀痕，均未見脫片現象，肉眼可見切片股骨頭完整性較好，軟骨區、骨小梁區、骺板區結構清晰，層次分明。光學顯微鏡下可見骨小梁結構完整，無折疊；軟骨細胞、骨細胞細胞形態清晰可見，細胞核無明顯收縮現象，細胞核與細胞質著色清晰，紅藍相間，色彩鮮艷；脂肪細胞、小血管等結構分明，色澤鮮明。見圖1、2。

圖1 軟骨細胞，HE染色 40×10倍

圖2 骨細胞及脂肪細胞，HE染色 40×10倍

3 討 論

脫鈣是指用物理或化學方法將骨組織標本中的有機組織和鈣鹽分離，通過去除鈣鹽和無機鹽從而獲得完整的膠原纖維組織，只有去除無機鹽物質，才能使組織軟化行切片染色觀察[3]，可見股骨頭組織制片脫鈣液的選擇是制片成功的關鍵。脫鈣若不徹底，鈣鹽遺留，切片易破碎、殘缺，影響制片的質量；脫鈣過度，則脫鈣液中的酸類物質又會損傷組織中的抗原，破壞組織細胞的形態結構，導致染色效果不佳。

目前，骨組織切片常選用的脫鈣液包括以硝酸為主的酸性脫鈣液和乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液。硝酸盡管具有脫鈣能力強、時間短等優點，但易出現脫鈣過度，細胞明顯腫脹至使細胞結構不完整，細胞核染色能力減弱，返藍困難而至細胞核呈淡紅色，對比度明顯降低[4]。EDTA是一種優良的脫鈣螯合劑，對組織破壞極小，能保持組織細胞的完整結構，尤其細胞顯微化學改變甚微，且能保存組織中的抗原物質和某些酶類的活性，但EDTA脫鈣液脫鈣作用較緩慢，短者數周常者數月，不適用于大面積骨組織脫鈣[5]。

本研究選用甲酸混合酸脫鈣液輔以三氯化鋁，其中甲酸對組織的破壞程度較輕，脫鈣時間范圍寬松；鹽酸可明顯增加脫鈣速度，而且對組織具有收縮作用；三氯化鋁的加入，鋁離子易被吸附的特性可以起到保護劑的作用，從而減緩鹽酸對細胞核著色的影響，同時它又是HE染色蘇木精的媒染助染劑，可輔助得到優良的染色效果。且甲酸混合酸脫鈣液脫鈣時間僅1周，脫鈣中間不換液，不水洗，組織損傷較少，即可保證脫鈣徹底，又可使各結構層次不分離，取得良好的染色效果。此外，還發現脫鈣后充分水洗也是影響制片成功的因素之一，組織脫鈣后經流動的自來水充分沖洗，自來水的弱堿性可中和殘留在組織中的脫鈣液酸性，有利于切片的蘇木素著色。

綜上所述，甲酸混合酸脫鈣液輔以三氯化鋁對骨組織標本脫鈣有一定的優越性，值得在臨床實驗中使用。

[1]Poignard A，Lebouvier A，Cavet MA，et al.New preclinical porcine model of femoral head osteonecrosis to test mesenchymal stromal cell efficiency in regenerative medicine[J].Int Orthop，2014，38(9):1837-1844.

[2]Hwang Y，Park J，Choi SH，et al.Traumatic and Non-traumatic osteonecrosis in the Femoral Head of a Rabbit Model[J].Laboratory Animal Research，2011，27(2):127-131.

[3]戚亦萍，吳明媛，王明海，等．兔膝關節炎骨關節組織切片的制備方法[J]．上海交通大學學報:農業科學版，2009，27(3)：314-317．

[4]羅燦嶠，莫木瓊，鐘覺民．不同的脫鈣液在骨組織制片中的比較應用[J]．中國實用醫藥，2011，6(19)：27-28．

[5]沈溪明，何欣欣，吳東霞，等．不同濃度和pH值EDTA脫鈣液對下頜骨免疫組化結果的影響[J]．臨床與實驗病理學雜志，2014，30(6)：696-698．

瀘州醫學院校級課題 (2013ZRQN073)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.038

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1672-9455(2015)10-1426-01

2014-11-05

2015-02-05)