環磷酰胺對斷奶仔豬免疫功能的影響

武漢工業學院動物營養與飼料科學湖北省重點實驗室 韓 杰 劉玉蘭* 洪 宇 吳志鋒

在豬的生產中，免疫系統發育不完善、斷奶應激、大量接觸病原微生物等因素易導致斷奶仔豬發生免疫抑制（袁書林，2006），從而降低其生長性能，增加其疾病易感性和死亡率。目前，環磷酰胺（CY）是各種免疫抑制藥物中作用最強、應用最廣泛的藥物之一。大量動物試驗證明，CY可抑制機體免疫功能（He等，2007； 趙戈清等，2005；El-Abasy等，2004）。但是，由于CY的藥理功效復雜，對不同動物的毒作用劑量、毒作用點和毒作用程度均不同，且在豬上的模型較少，本試驗用CY構造仔豬免疫抑制模型，從細胞免疫、體液免疫、細胞因子釋放等方面觀察了仔豬免疫功能的變化，旨在為仔豬免疫增強劑的研究和開發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CY為蘇州尤利特生物醫藥科技有限公司產品，純度 ≥99.3%；辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG、刀豆蛋白A（Con A）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、植物血凝素（PHA）、卵清蛋白（OVA）均為Sigma產品；RPMI-1640培養基為Hyclone產品；淋巴細胞分層液為中國醫學科學院生物工程研究所產品；胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產品；牛血清白蛋白（BSA）為Roche產品；四甲基聯苯胺（TMB）為北京博奧森生物技術有限公司產品。

1.2 試驗動物與試驗設計 選用12頭（28±3）d的杜×長×大斷奶仔豬，預試1周，按完全隨機區組設計將其分為對照組和CY組，每個處理6個重復，每個重復1頭豬。試驗期14 d。第1天和第7天，給CY組仔豬注射50 mg/kg BW的CY，對照組仔豬注射等量的生理鹽水。另外，第1天所有仔豬從耳后肌肉注射BSA（終濃度1 mg/kg BW）。參照NRC（1998）斷奶仔豬的營養需要配制基礎日糧，日糧組成及營養水平見表1。

表1 日糧組成及營養水平

1.3 血液樣品采集 于試驗的第7天和第14天，從仔豬的前腔靜脈采血：用非抗凝真空管采血，3500 r/min離心10 min后，分離血清，測定血清BSA抗體、IgG及細胞因子含量；用EDTA K3抗凝采血管采血1 mL用于白細胞分類計數；用肝素抗凝真空管采血7 mL，測定外周血淋巴細胞轉化率。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 白細胞分類計數的測定 血液白細胞含量及其分類計數采用日本Sysmex K4500血液自動分析儀測定。

1.4.2 細胞免疫的測定 通過測定遲發型超敏反應和外周血淋巴細胞轉化率來反映仔豬細胞免疫功能。

1.4.2.1 外周血淋巴細胞轉化率 從仔豬前腔靜脈用肝素抗凝真空管采血7 mL。取10 mL離心管加淋巴細胞分層液4 mL，然后沿管壁緩緩疊加血3 mL，2500 r/min離心30 min，取中間白細胞部分， 用3～5倍體積無 Ca2+、Mg2+Hank’s液洗 3次，每次2000 r/min離心10 min。然后將細胞懸浮于RPMI-1640完全培養液，用臺盼藍染色計數活細胞數（＞95%），調整細胞濃度為 2×106個/mL。然后將淋巴細胞懸液加入96孔細胞培養板中，加入Con A（終濃度為8 μg/mL）；另一組加入等體積的培養液為對照，培養體系為每孔200 μL。置5%CO2、37℃培養 72 h。在培養結束前 6 h，每孔加入10 mL MTT（初始濃度為5 mg/mL），繼續培養。培養結束后，每孔加入100 μL 10%SDS-0.04 mol/L HCl溶液，繼續培養2 h，使紫色結晶完全溶解，用酶聯免疫檢測儀在570 nm下測定OD值。

1.4.2.2 遲發型超敏反應 參照Kornegy等（1989）的方法，在仔豬左腿內側距最后乳頭5 cm及距腹中線5 cm處皮下注射0.1 mL PHA（150 μg/0.1 mL），右側對稱部位注射等量的生理鹽水，24 h后用游標卡尺測定雙側注射部位皮褶厚度的變化。

1.4.3 體液免疫的測定 通過測定血清免疫球蛋白G（IgG）和BSA抗體水平來反映仔豬體液免疫功能。

IgG水平用免疫比濁法測定，嚴格按照試劑盒（北京華英生物技術研究所產品）說明書進行。

BSA抗體水平用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定的操作程序進行：BSA抗原用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至 10 μg/mL，包被酶標板，每孔100 μL，4 ℃過夜，洗滌液（0.01 mol/L pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液中加0.05% 吐溫20）洗板3次，然后每孔加封閉液（PBS中加 0.03%OVA）200 μL，37℃封閉2 h。洗板3次后，將稀釋好的血清（1∶80）加入酶標板中，每孔100 μL，每個樣品3個重復，另取陰性血清稀釋后作負對照，37℃溫育1 h。洗板3次，加入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG，每孔100 μL室溫下反應1 h。洗板3次后，每孔加入100 μL新配制的TMB底物顯色液，室溫下反應15 min。顯色反應結束時，每孔中加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應，用酶標儀在450 nm處測定OD值。

1.4.4 細胞因子的測定 干擾素-γ（IFN-γ）采用豬的ELISA試劑盒（R&D Systems Inc.）方法測定；白細胞介素2（IL-2）采用豬的ELISA試劑盒方法（Uscnlife Science and Technology Co.）測定。

1.5 數據統計分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行t-檢驗分析CY組和對照組之間的差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.10表示具有顯著性趨勢。

2 結果與分析

2.1 白細胞分類計數 由表2可知，CY顯著降低第14天斷奶仔豬的白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數量（P<0.05），并且具有降低第7天嗜中性粒細胞和第14天單核細胞數量的趨勢（P<0.10）。

表2 環磷酰胺刺激對斷奶仔豬白細胞分類計數的影響

2.2 細胞免疫 由表3可知，CY對Con A誘導的淋巴細胞轉化率和PHA刺激的皮褶厚度無顯著影響。

表3 環磷酰胺刺激對斷奶仔豬細胞免疫的影響

2.3 體液免疫 由表4可知，CY對IgG和第7天斷奶仔豬的BSA抗體水平無影響，但顯著降低了第14天BSA抗體水平（P<0.05）。

表4 環磷酰胺刺激對斷奶仔豬體液免疫的影響

2.4 細胞因子 由表5可知，CY對IL-2及第14天的IFN-γ水平無影響，但顯著降低第7天的IFN-γ 水平（P<0.05）。

表5 環磷酰胺刺激對斷奶仔豬細胞因子的影響

3 討論

CY是一種烷化劑，臨床上主要用于治療腫瘤自身免疫性疾病和器官移植等，其在體外無活性，進入體內，可在肝微粒體酶的作用下，分解出烷化作用很強的氯乙基磷酞胺，并與細胞內DNA交練結合，通過與DNA雙鏈交叉連接破壞DNA，從而破壞免疫活性細胞，抑制細胞的增殖，具有較強的免疫抑制作用。因此，研究上常用大劑量的CY來構建動物免疫抑制模型（許愛華等，2008；董曉芳等，2007；He等，2007）。

當機體發生炎癥或其他疾病時都可引起白細胞總數及各種白細胞的百分比發生變化。因此，白細胞分類計數是反映豬的免疫狀況的常用指標之一（Tan等，2009）。本試驗中，CY可降低第7天的中性粒細胞數及第14天的白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞數，表明仔豬的免疫功能受到一定程度的抑制。這與孫月平等（1999）、王盛民等（2006）、張炳華和劉新軍（2008）的研究結果類似。

本試驗中，從遲發型超敏反應和淋巴細胞轉化率這兩個指標可以看出，CY對細胞免疫功能無顯著影響，這與袁書林（2006）、Hou 等（2007）和陳慶（2008）的結果不一致。這可能與試驗設計、試驗動物種類和健康狀況、試驗動物自身細胞免疫功能水平、CY的注射劑量及注射方式等不同有關。

BSA為一種異源蛋白抗原，具有胸腺依賴性，其抗體產生需要Th細胞的協助。免疫前仔豬血清中BSA抗體水平應為零，在經過抗原BSA刺激后，機體的免疫系統被激活，更多的蛋白質用于抗體的合成，抗體水平升高。本試驗中，CY顯著降低了第14天BSA抗體水平，這與He等（2007）的結果一致，表明CY抑制了仔豬的體液免疫功能。

根據細胞因子產生的不同，CD4+的Th細胞可分為Th1和Th2亞群。Th1分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，提升機體免疫效應；Th2分泌IL-4、IL-10等細胞因子，參與免疫抑制或免疫耐受（Raymond和 Wilkie，2004）。 在體內，Th1 和 Th2 以及相應的細胞因子含量的變化往往意味著機體免疫狀態的變化，Th1及IL-2、IFN-γ等細胞因子的增加意味著機體免疫上調，Th2及IL-4、IL-10等因子的增加往往意味著免疫耐受或免疫下調（Ichiyama等，2006）。本試驗發現，CY可降低第7天的IFN-γ水平，這與何榮（2005）與彭廣華（2007）的報道一致。該結果提示：CY可抑制仔豬體內同源淋巴細胞活化，誘導分泌IFN-γ等細胞免疫上調因子的Th1減少，意味著機體免疫水平受到抑制。

4 小結

本試驗表明，CY降低了斷奶仔豬白細胞、單核細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量及BSA抗體和IFN-γ水平，使其免疫功能受到一定程度的抑制，但其對遲發型超敏反應和淋巴細胞轉化率無影響。有關CY對斷奶仔豬細胞免疫功能的影響仍需要進一步研究，進而確定CY最佳劑量和注射方式。

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