替米沙坦上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的機(jī)制

鄭振偉

血管緊張素受體阻斷劑 （angiotensin receptor blockers，ARBs）目前已廣泛用于高血壓病的治療。近年來相關(guān)研究顯示替米沙坦等ARBs除具有拮抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)的作用外，還可以通過上調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)來調(diào)節(jié)糖脂代謝[1-6]。而糖脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)可能與激活過氧化物酶體增殖物活化受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）有關(guān)[8，9]，但是具體的機(jī)制尚不清楚。 基于此，筆者通過觀察替米沙坦和 PPARγ阻斷劑GW9662對體外培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響，探討PPARγ在替米沙坦上調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清購自杭州四季青公司，DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司，胰蛋白酶購自上海華美生物工程公司，1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、地塞米松和胰島素均購自Sigma公司，替米沙坦購自上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，GW9662購自Merck公司，脂聯(lián)素抗體和β-actin抗體均購自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和鑒定 3T3-L1前脂肪細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，按照如下方法進(jìn)行誘導(dǎo)分化：將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞融合后，加入含0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 μg/ml胰島素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，再以含10 μg/ml胰島素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，隨后以DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6 d。

油紅O染色法鑒定脂肪細(xì)胞：10%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，洗滌后，加油紅O染液，染色10 min，異丙醇洗滌細(xì)胞2次。水洗5～10 min，倒置顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.2 替米沙坦和GW9662干預(yù)3T3-L1脂肪細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)采用替米沙坦及PPARγ拮抗劑GW9662干預(yù)3T3-L1脂肪細(xì)胞。具體如下，誘導(dǎo)分化后的3T3-L1脂肪細(xì)胞洗去培養(yǎng)液，無血清條件下培養(yǎng)16 h后分入下列實(shí)驗(yàn)組：①替米沙坦組 （10 μmol/L)；②替米沙坦組（10 μmol/L）＋GW9662組（30 μmol/L)；③GW9662組（10 μmol/L）；④空白對照組。 各實(shí)驗(yàn)組干預(yù)24 h后獲取3T3-L1脂肪細(xì)胞。

1.2.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)測定采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平。取部分干預(yù)后的3T3-L1脂肪細(xì)胞，各組細(xì)胞分別提取總RNA，RT-PCR法逆轉(zhuǎn)錄至cDNA，脂聯(lián)素引物參照Gengbank提供的序列，用Primer5.0合成，由上海生物工程公司合成。引物設(shè)計(jì)如下：5’-TGTTGGAATGACAGGAGCTGAA-3’（forward）；5’-CACACTGAAGCCTGAGCGATAC-3’（reverse）。應(yīng)用SYBR GreenⅠ熒光燃料技術(shù)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算機(jī)分析Ct值。

1.2.4 3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素蛋白表達(dá)測定 采用Western-blot法測定3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素蛋白水平。取部分干預(yù)后的3T3-L1脂肪細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，BCA法測定蛋白濃度。常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入如下抗體：脂聯(lián)素抗體和β-actin抗體，4℃輕搖過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)，X線壓片曝光，用GSD8000密度掃描分析系統(tǒng)（英國UVP公司）進(jìn)行圖像分析，以脂聯(lián)素與β-actin條帶的吸光面積積分比值來評定脂聯(lián)素的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均先求出均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），各組數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較及兩兩比較采用ANOVA方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定 誘導(dǎo)分化10 d左右的3T3-L1細(xì)胞90%呈脂肪細(xì)胞表型，細(xì)胞內(nèi)可見明顯脂滴。油紅“O”染色后可見誘導(dǎo)后的3T3-L1細(xì)胞中紅染的脂肪滴。

2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)測定 實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示：與空白對照組相比，經(jīng)GW9662干預(yù)后3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平明顯降低 （P=0.035）；替米沙坦組脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平明顯增加 （P=0.049）；替米沙坦＋GW9662組（替米沙坦＋GW組）脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平有增高趨勢，但與空白組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.376，圖1）。

2.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素蛋白表達(dá)測定Western blot檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，GW9662干預(yù)后3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素蛋白表達(dá)水平有降低趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.295）；替米沙坦組3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素蛋白表達(dá)水平明顯增加（P=0.017）；替米沙坦＋GW9662組脂聯(lián)素蛋白表達(dá)水平有增高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P=0.376），見圖2。

圖1 3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR測定

圖2 3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素蛋白表達(dá)western測定

3 討 論

脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白激素，在糖脂代謝過程中起著重要的作用，對胰島素抵抗、代謝綜合征等有著重要的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)受PPARγ活性等多種因素影響[10]。

研究顯示替米沙坦等ARBs在降壓的同時(shí)可以上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)水平，還發(fā)現(xiàn)替米沙坦等ARBs具有獨(dú)立于血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻斷的的PPARγ激活作用[9]，因此提示替米沙坦等ARBs上調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)可能與激活PPARγ作用有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚，基于此筆者進(jìn)一步探討了PPARγ在ARBs上調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)中的作用。

本文結(jié)果顯示，采用GW9662特異性阻斷PPARγ后，3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平下降，進(jìn)一步提示PPARγ活性在脂聯(lián)素基因轉(zhuǎn)錄水平具有一定程度的調(diào)節(jié)作用。此外，本文結(jié)果還顯示替米沙坦可以明顯增加脂聯(lián)素mRNA和蛋白表達(dá)水平，而GW9662可以在一定程度上抑制替米沙坦上調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)的作用。由此可見，PPARγ活性在替米沙坦上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)過程中可能起著一定程度的作用。然而，由于脂肪細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素還受其它因素影響，除PPARγ激活通道外替米沙坦等ARBs上調(diào)脂肪細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素是否還存在其它機(jī)制，還需進(jìn)一步研究探討。

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