TGF-β受體Ⅰ型、Ⅱ型在實驗性鼠牙髓炎中的免疫組化研究

韓 杰,楊青嶺,樸松鶴

(1.佳木斯大學校醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154007;2.佳木斯大學口腔醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154002)

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)是一族具有多種生物學功能的細胞因子,對細胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化過程起著重要作用,有利于胚胎發(fā)育和細胞修復,參與牙胚的發(fā)生、發(fā)展、成熟以及牙體組織的修復過程[1]。在哺乳動物,已發(fā)現(xiàn)7種 I型受體和5種Ⅱ型受體[2]。轉(zhuǎn)化生長因子受體 (TGF-β R)包括 TGF-β RⅠ、Ⅱ、Ⅲ型3種形式。TGF-β RⅠ、Ⅱ參與了牙胚的發(fā)育及成牙本質(zhì)細胞、成釉細胞的分化。TGF-β RⅠ、Ⅱ在鼠、牛以及人第三磨牙牙髓細胞、成牙本質(zhì)細胞的表達均有報道[3]。本實驗采用免疫組化方法檢測大鼠可復性牙髓炎模型中不同時間 TGF-β RⅠ、Ⅱ的動態(tài)表達及定位情況;并探討其在牙髓損傷修復過程中的生物學作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑

昆明產(chǎn) Wistar大鼠 ,雄性 ,24只 ,體重 250～ 300g,購自佳木斯大學醫(yī)學動物中心。TGF-β RⅠ、Ⅱ抗體,免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2 方法

根據(jù)不同的處死時間將24只大鼠隨機分為6組。每組4只,即 0d組(正常組 )、1d組、3d組、5d組、7d組、2周組。10%水合氯醛(3mL/kg)腹部注射麻醉后仰臥固定,用備好的高速渦淪鉆分別在大鼠左右上頜第一磨牙合面進行機械性不噴水鉆磨,均勻磨除釉質(zhì)厚度0.5mm,然后用酸蝕劑處理暴露的牙本質(zhì)表面5min,正常組不做處理。各組鼠分別于0d、 1d、3d、5d、7d、 2w脫頸處死 ,迅速截取左右上頜第一、二、三磨牙連同部分頜骨標本,立即將組織塊放入10%甲醛溶液4℃固定48h,經(jīng)20%EDTA脫鈣10 w后,流水沖洗24h,系列乙醇脫水、二甲苯置換,石蠟包埋,各標本作4 μm厚的石蠟切片 3張,1張用于 HE染色 ,2張用于免疫組化染色。免疫組化染色使用武漢博士德公司試劑盒,按其說明書操作。石蠟組織標本4 μm切片經(jīng)脫蠟至水,30 μL過氧化氫液室溫孵育10min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。100μL正常山羊血清室溫孵育 10min,傾去血清。滴加 1滴 (50 μL)1∶200稀釋的TGF-β 1抗體,4℃過夜,加生物素化第二抗體,室溫孵育10min。以上各步之后均用0.01mol/L PBS洗5min3次。 DAB鏡下控制顯色。陽性對照為乳腺癌組織,陰性對照用 PBS代替一抗。蘇木素復染,中性樹膠透明封片 ,觀察。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

1d組鏡下可見血管擴張充血,水腫,壓迫成牙本質(zhì)細胞成扁平狀,少量炎細胞浸潤。3d組鏡下可見血管擴張充血明顯,大量炎細胞浸潤,成牙本質(zhì)細胞可見空泡性變。5d組鏡下可見血管擴張充血,水腫,牙本質(zhì)層下方可見少量修復性牙本質(zhì)形成,少量炎細胞。7d組鏡下可見血管充血,水腫,牙本質(zhì)層下方可見大量修復性牙本質(zhì)形成,少量炎細胞。2w組牙本質(zhì)層下方可見大量修復性牙本質(zhì)形成。

2.2 免疫組化結(jié)果

TGF-β RⅠ、Ⅱ的染色結(jié)果相似 ,0d組牙本質(zhì)細胞呈陽性表達,牙髓細胞呈弱陽性表達;1 d組成牙本質(zhì)細胞呈強陽性表達,牙髓細胞為弱陽性表達,3d組成牙本質(zhì)細胞呈強陽性表達,牙髓成細胞為陽性表達,5d組成牙本質(zhì)細胞、牙髓維細胞陽性表達,血管壁及內(nèi)皮細胞可見陽性表達,7d組成牙本質(zhì)細胞、牙髓維細胞呈陽性表達,至2w組成牙本質(zhì)細胞、牙髓成細胞呈陽性,修復牙本質(zhì)可見弱陽性表達。

2.2.1 TGF- β RⅠ 的表達

2.2.2 TGF- β RⅡ 的表達

3 討論

3.1 TGF-β R與反應性牙本質(zhì)的形成

本實驗表明,3d組、5d組表現(xiàn)為牙髓炎急性期,TGF-β RⅠ、Ⅱ在成牙本質(zhì)細胞均強陽性表達。這與 Sloan[5]的報道結(jié)果一致。TGF-β RⅠ、Ⅱ在成牙本質(zhì)細胞強陽性表達,說明成牙本質(zhì)細胞對 TGF-β的反應性很強,TGF-β在牙髓炎急性期期積極參與炎癥因子遞呈,協(xié)調(diào)免疫炎癥反應平衡,保護損傷牙髓組織,刺激成牙本質(zhì)細胞合成和分泌牙本質(zhì)基質(zhì)成份,形成反應性牙本質(zhì)。研究表明,在牙髓組織炎癥損傷和修復中,TGF-β抑制細菌及其毒性產(chǎn)物對牙髓組織造成的損傷,如激活巨噬細胞,趨化單核細胞和中性粒細胞,刺激其 LI- lβ、 TN F- α、 LI-6、 bFGF等多肽因子的表達 ,以清除和殺滅細菌及其毒素,抑制和滅活 H2O2、NO等,降低自然殺傷細胞的生成 ,限制免疫反應過度增強[5]。7 d、2w組表現(xiàn)牙髓炎癥恢復期,TGF-β RⅠ、Ⅱ在成牙本質(zhì)細胞中均陽性表達,顯示 TGF-β可能參與牙髓修復過程。Tziafas等[6]研究了外源性 TGF-β 1對修復性牙本質(zhì)的誘導作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)預先用 TGF-β 1中和抗體浸泡的脫鈣牙本質(zhì)完全失去誘導成牙本質(zhì)細胞分化的活性,含 TGF-β1的 Milipore膜周圍有一厚層管狀基質(zhì)形成,并有大量伸長極化的成牙本質(zhì)細胞樣細胞包繞。Hu等[7]學者用 TGF-β1進行蓋髓實驗也證實,TGF-β1能夠誘導修復性牙本質(zhì)的形成。這些研究都說明,TGF-β R在在牙髓損傷修復和反應性牙本質(zhì)的形成過程中起著重要的作用。

3.2 TGF-β R與修復性牙本質(zhì)的形成

牙髓作為機體內(nèi)的一種特殊組織,其損傷修復機制也同樣具有獨特性。牙髓組織在創(chuàng)傷感染時,通過復雜的網(wǎng)絡調(diào)節(jié)使未分化間充質(zhì)細胞、牙髓細胞增殖、分化,分泌細胞外基質(zhì)形成牙本質(zhì)橋而獲得自身修復的能力。這也是追求牙髓活髓保存治療的依據(jù)。本實驗表明,3d組、5d組表現(xiàn)為牙髓炎急性期,7d組牙髓炎癥恢復期,TGF-β RⅠ、Ⅱ在牙髓細胞均陽性表達 ,比 0d組、1d組表達增強。表明這些牙髓細胞對TGF-β的反應性增強,TGF-β促進牙髓細胞增殖、分化為成牙本質(zhì)細胞樣細胞,替代受損成牙本質(zhì)細胞,分泌修復性牙本質(zhì)。本實驗從 TGF-β受體角度研究,觀察 TGF-βⅠ、Ⅱ受體在大鼠牙髓細胞的表達與分布情況,研究 TGF-β作為一種有效的生物活性因子,作用于成牙本質(zhì)細胞和牙髓細胞表面的 TGF-βⅠ、Ⅱ受體,一方面促進成牙本質(zhì)細胞分泌胞外基質(zhì)形成反應性牙本質(zhì);另一方面促進牙髓細胞生長、分化為牙本質(zhì)樣細胞,代替受損的成牙本質(zhì)細胞,形成修復性牙本質(zhì)。TGF-β RⅠ、Ⅱ的表達水平可能決定著細胞對TGF-β因子的反應,從而可提高牙本質(zhì)牙髓復合體的自身修復再生能力,是牙髓組織損傷修復的重要機制之一。因此,推測 TGF-βⅠ、Ⅱ受體在牙髓組織損傷修復過程中具有重要作用。

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