不同稀釋液對血清中HBsAg定量測定的影響

(南京大學醫學院附屬南京鼓樓醫院檢驗科，江蘇南京 210028)

我國是乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)感染的高發區，HBV感染的診斷主要依賴于患者血清中病毒標志物和病毒核酸(HBV DNA)的檢出。乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是HBV表面的外膜蛋白，由病毒S基因編碼，在病毒感染肝細胞過程中起重要作用。最近一些研究證明HB-sAg 和 HBV DNA 水平之間有良好的相關性［1－2］，定量檢測血清中HBsAg可以反映宿主體內HBV DNA的水平，對評價抗病毒藥物治療的療效和判斷預后有重要意義［3］，同時對于一些HBV DNA呈陰性的慢性乙肝患者，血清中HBsAg的含量就為臨床醫生的診斷及治療提供了良好的依據。目前，我院采用ARCHITECT i2000SR化學發光分析儀對血清中的HBsAg進行定量檢測。臨床上有些乙肝患者HBsAg定量測定結果超出該儀器所能檢測的線性范圍，為了得到準確、可靠的實驗結果，幫助臨床醫生更好地了解疾病進展，常需要對高濃度HBsAg血清進行稀釋后再測定。

1 材料和方法

1．1 血清標本

篩選收集乙肝患者血清 HBsAg定量＞250 IU·ml－1的標本血清，標本來源于南京市鼓樓醫院門診。標本要求無明顯溶血、脂血。

1．2 混合低值血清制備

收集本院住院病人中乙肝兩對半定量結果全陰性的血清標本，混勻后2 000 r·min－1離心取其上清液(經檢測 HBsAg 為 0．02 IU·ml－1)。

1．3 儀器與試劑

美國雅培公司生產的ARCHITECT i2000SR全自動化學發光儀及配套試劑(含HBsAg專用稀釋液)、生理鹽水、蒸餾水、自制混合低值血清等。

1．4 實驗方法

將不同患者的高濃度 HBsAg血清(＞250 IU·ml－1)分別用專用稀釋液、生理鹽水、混合低值血清及蒸餾水按照1∶100的比例(5 μl血清加入495 μl稀釋液)稀釋，充分混勻后取雙份上機檢測HBsAg含量。操作步驟嚴格按說明書進行，測定在1 h內完成。

1．5 統計方法

用Microsoft Excel系統對數據進行分析，組間比較用配對t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

高值HBsAg血清標本分別用HBsAg專用稀釋液、生理鹽水、混合低值血清及蒸餾水按照1∶100比例稀釋后經ARCHITECT i2000SR化學發光儀測HBsAg濃度值，結果見表1。

表1 高濃度HBsAg用不同稀釋液稀釋后的測定結果及偏差Tab 1 The results of concentration of HBsAg diluted with different diluents

生理鹽水和蒸餾水作為稀釋液后的測定值與專用稀釋液稀釋后的測定值相比，P＜0．05，有統計學差異，所以在日常檢測中，不能用生理鹽水或蒸餾水作為化學發光免疫分析法測定HBsAg的稀釋液;而混合低值血清稀釋后的測定值與專用稀釋液相比偏差較小，P＞0．05，差異無統計學意義，故混合低值血清可以作為替代稀釋液用于化學發光免疫分析法測定HBsAg。

3 討 論

雅培ARCHITECT i2000SR全自動免疫分析儀核心技術為化學發光微粒子免疫分析(chemiluminesent micropaticle immunoassay)，以吖叮酯作為標記發光劑，主要用于測定蛋白質、病毒抗原等大分子物質，試劑具有極高的靈敏度、特異性和穩定性。它對HBsAg的可測范圍是0～250 IU·ml－1，而臨床上有些血清的HB-sAg往往超出了該檢測范圍，所以需要稀釋后再測定，但是由廠家提供的專用稀釋液價格相當昂貴且保存有效期很短，有時會有供貨不及時或稀釋液超過有效期的情況發生。本研究通過用生理鹽水、混合低值血清、蒸餾水作為稀釋液來稀釋高濃度的HBsAg血清，旨在探討三者對血清HBsAg測定的影響，以期選擇出合適的稀釋液來代替專用稀釋液。免疫反應體系中的蛋白分子種類及含量、pH值、離子強度對免疫反應本身有較大影響。待測血清經稀釋后如果反應體系發生明顯變化，則會影響檢驗結果的準確性［4］。

通過這3種稀釋液分別對11份不同乙肝患者血清稀釋后進行測定，比較偏差計算結果發現用生理鹽水及蒸餾水稀釋后測得的結果都偏高，均存在明顯偏差，分別為 －2．05% ～157．81%、－16．32% ～313．64%，而用混合低值血清稀釋后的偏差為－35．03% ～32．60%，與專用稀釋液稀釋后測定值比較，差異無統計學意義。可能因為低值混合血清的蛋白質、pH值、離子強度和其他血清成分與樣本血清基本相近，因此其測定結果偏差最小。因只對較高濃度HBsAg的血清標本(一般＞250 IU·ml－1)進行稀釋，所以用混合低值血清稀釋測定的偏差并不影響對HBsAg定量結果的陰陽性判定，僅對其高濃度的值有所影響，而這個結果應該是可以接受的。生理鹽水的離子強度、pH值與血清相近，但缺乏蛋白質和血清成分，所以測定結果偏差較大。而蒸餾水與血清相比在蛋白質、pH值方面均相差較大，不適宜作為免疫反應的血清稀釋液，這與丁忠旗等［5－7］研究結果一致。考慮到胎牛血清在離子強度、pH值方面與人血清接近，另選取5份高濃度HBsAg的血清標本稀釋后進行比較，發現與專用稀釋液比較偏差亦較大，可超過100%(結果未在表1中列出)，可能是胎牛血清中所含蛋白種類和人血清相比有一定差異，對整個反應體系有影響所致。

本實驗結果表明，雅培ARCHITECT i2000SR全自動免疫分析儀在測定HBsAg濃度時，如遇到超出儀器線性范圍(＞250 IU·ml－1)的標本需進行稀釋，除專用稀釋液外，低值血清可以作為替代稀釋液使用，以測定高濃度HBsAg的實際值來觀察患者病情及轉歸。

［1］孫長義，王山梅．乙肝病毒標志物與PCR-HBV定量水平的關系［J］．中國公共衛生，2002，18(12):1480-1481．

［2］侯遠沛，宋麗．乙型肝炎標志物定量檢測結果與HBV-DNA含量相關性分析［J］．實用醫技雜志，2004，11(10):2112-2113．

［3］陳祥勝，廖雯君．乙肝HBsAg定量檢測的臨床診斷意義［J］．湖北中醫學院學報，2009，11(2):21-23．

［4］高云朝，楊亞東，陸漢魁．稀釋介質對化學發光免疫分析檢測血清HCG的影響［J］．標記免疫分析與臨床，2007，14(2):121，72．

［5］丁忠旗，李永培，盛強．不同稀釋液對高濃度HCG測定值的影響［J］．中華核醫學雜志，2002，22(1):39．

［6］朱誠憶，胡建軍．不同稀釋液對RIA測定高濃度AFP的影響［J］．上海醫學檢驗雜志，2000，15(3):140．

［7］陳春華．探討用不同稀釋液對RIA測定高濃度AFP的影響［J］．華西醫學，2003，18(2):247．