葡萄酒釀造及葡萄酒酵母菌種的改良

王曉飛，吳曉玉，孔令保

（江西農業大學生物科學與工程學院發酵應用技術南昌市重點實驗室，江西南昌330045）

葡萄酒釀造及葡萄酒酵母菌種的改良

王曉飛，吳曉玉，孔令保*

（江西農業大學生物科學與工程學院發酵應用技術南昌市重點實驗室，江西南昌330045）

釀酒酵母是一種重要的工業微生物，是葡萄酒品質的靈魂。在無氧條件下，由葡萄轉化成葡萄酒的過程中，釀酒酵母起了至關重要的作用。敘述了葡萄酒酵母與葡萄酒釀造的關系，介紹了工業化葡萄酒發酵過程中的調控手段及當前應用現代科技手段選育優良葡萄酒酵母菌種的方法，最后，對當前釀酒行業的形勢和未來作出了預測和展望。

酵母，葡萄酒，DNA微陣列技術，LONWORKS技術，菌種選育

葡萄酒是一種營養豐富的低酒精度發酵飲料。葡萄酒釀造是在釀酒酵母的作用下，采用自然發酵或者純種發酵將葡萄原料中的各種潛在質量在酒中充分發揮出來。釀酒酵母是一種應用廣泛的工業微生物，長期以來它被用于發酵生產面包和酒精飲料，近來，酵母又被廣泛用于制藥行業和塑料工業，作為“細胞工廠”生產胰島素、聚酮和L-乳酸等。釀酒酵母也是進行真核生物研究的一種很好的模式生物。自從1996年釀酒酵母全基因組測序工作的完成，人們對葡萄酒酵母的復雜代謝過程有了越來越多的認識，研究人員深入開展了酵母的分子生物學研究［1］。基因組測序獲得的巨大生物學信息量呼喚新的后基因組學研究如酵母基因表達調控機制的研究，高通量的組學研究如基因組學、轉錄物組學、蛋白質組學和代謝物組學研究，以及應用生物信息學對獲得的生物信息進行分析整合的系統生物學研究。在現代葡萄酒發酵過程中應用LONWORKS系統，通過計算機遠程通訊將所有酒罐的信息儲存在網絡服務器上，工作人員隨時可以查閱酒罐溫度、儲量、密度等信息，實現對發酵過程的現代化、網絡化、自動化的監控與調控。為了滿足不同地區、不同人群、不同風格的葡萄酒消費需求，優良葡萄酒酵母的選育工作尤其重要。傳統的自然篩選、采用理化因素的誘變等經典的育種手段仍是目前實用的常規技術，隨著現代科技的發展，出現了很多選育酵母的新技術如基因重組、基因工程育種等手段。

1 葡萄酒釀造的關鍵因子——葡萄酒酵母

葡萄酒是以葡萄汁為原料，在一定條件下經酵母部分或完全發酵所得的低度飲料酒。從物理化學角度，葡萄酒可以定義為一種非理性的、多組成分的透明溶液，包含主要成分水、酒精、甘油和有機酸，次要成分如芳香氣味和石碳酸復合物等［2］。其風味物質主要來源于葡萄本身和由酵母發酵代謝產生的物質，其含量和組成比例決定著葡萄酒的特性。

酵母是葡萄酒釀造的靈魂。在無氧條件下，由葡萄轉化成葡萄酒的過程中，釀酒酵母的作用至關重要。在自然或自發發酵情況下，微生物的群體消長現象是自發進行的，其必要條件也隨時間的變化而改變，包括真菌、酵母、細菌（醋酸菌、乳酸菌）和病毒（真菌病毒和抗菌素）的相互作用。微生物群體間的相互作用引發協同效應，促使芳香類化合物的生成，這類化合物不是簡單的通過混合各純培養發酵的成分就能實現的。這點已由近期的代謝足跡技術，通過單純培養、混合發酵和將幾種酒混雜的方法，利用氣相色譜分析發酵產物中揮發性物質的組分，予以證實［3］。在實際應用中，葡萄酒活性干酵母為葡萄酒品質控制提供了非常有效的手段和保證。在發酵中，活性干酵母在數量上占相對優勢，能形成同質性及穩定性的群體，使葡萄酒釀造者更易于測試其純度、活性及酵母菌種特征。從生物技術角度，活性干酵母的應用對微生物學發酵過程具有深遠的影響。

另外，葡萄酒發酵過程中，必須防止一些有害微生物的侵染，如灰葡萄孢菌會影響風味獨特、高檔的貴腐葡萄酒的釀造，啤酒、葡萄酒、清酒釀造中出現過嗜殺酵母現象［4］，造成酵母污染，并影響酒的風味，甚至引起酒變質，阻礙釀酒的正常進行。近期，功能基因組技術的應用，在相應的工業環境條件下，對識別被協迫控制的基因、控制代謝的轉錄因子及相關的工藝性能具有重要的作用［5］。酵母作為一個體系明確的生物體，在可以操控的前提下，以其獨特的優良特性，成為研究“系統生物學”、洞悉特定環境條件下某一具體表型調節機制的“模式生物”［6］。

2 葡萄酒發酵操控

酒精發酵是一個動力學的、復雜的過程，在此過程中，由于環境培養條件發生巨大變化以及發酵酵母的生理活性，葡萄要經歷持續的轉變。釀酒工業化生產遠比實驗室條件下小量的葡萄酒制作艱難復雜。工業生產用釀酒酵母菌株與實驗室品系差異顯著，實驗室用的品種多為單倍體或雙倍體。工業用葡萄酒酵母菌株主要是雙倍體或非整倍體，個別多倍體表現出染色體長度的高度多態性［7］。實驗室培養用葡萄酒酵母菌株與工業生產用葡萄酒酵母菌株在對環境變化所作出的反應上也存在著明顯差異［8］。因此，為了保持細胞的完整性以及整個釀酒過程的代謝活性，釀酒酵母形成了一整套機制以靈活適應不斷變化的環境條件。下面簡要介紹葡萄酒發酵的操控手段：

在葡萄酒發酵操控系統中，要求精確地控制葡萄汁發酵溫度和密度，使發酵按照既定的質量要求發展。然而，發酵的動態復雜性使溫度很難人為控制，造成香味揮發、口感粗糙，甚至蠅蟲滋生、發酵驟停等惡性事件，因此需要一套完備的控制系統操控發酵過程。現代釀酒車間利用LONWORKS系統實現對發酵的操控目的。系統是由一個主機節點和若干個LON節點構成的集散系統。通過計算機遠程通訊將所有酒罐的信息儲存在網絡服務器上，在有關人員的聯網計算機上，可以隨時查閱所有酒罐的儲量、密度、液位、酒種、發酵過程的密度曲線、溫度曲線等實時數據和歷史數據。決策者及管理人員能夠及時掌握生產情況，進而進行生產調度和指揮，對釀造過程的生產管理和質量管理具有極高的使用價值。LONWORKS這一高新技術的引用顯示了釀酒行業正朝著網絡化和工業化的方向邁進［9］。

網絡組成分析（NCA）是一種由轉錄分析如DNA微陣列或SAGE重建調節信號的方法，用于確定發酵過程中位于某一特定的點的轉錄因子是否具有活性［10］。DNA微陣列技術是鑒別混合在一起的各種細菌的理想工具，可以得到細菌豐度和細菌種類的信息。利用該技術比對標準實驗室菌種、突變異種和工業酵母菌基因型，進而得到適合消費者和商家需要的理想酵母。微陣列技術也是評價基因表達的主要工具，這項技術可以用于發酵過程中陽性性狀的基因表達分析。尤其對獲得那些調控序列，即用于操控只能在上述條件下才能進行轉錄的自然的或被導入基因產物的表達是非常有幫助的。用SAGE和微陣列技術所獲得的結果相類似，但因為SAGE不需要精確了解酵母基因序列，因此SAGE對于新基因的發現是非常有意義的。

3 葡萄酒酵母菌種的改良

為了滿足不同地區、不同人群、不同風格的葡萄酒消費需求，優良葡萄酒酵母的選育工作尤其重要。真正優良的葡萄酒酵母應該具備起酵快，擁有連續發酵能力和可描述性，能耐酒精、高壓、高SO2、高溫，能產生甘油和糖苷酶，但不失芳香和口感，并且能使發酵過程進行地完全，殘糖少，酒體協調，易于長期儲存等優點［11］。葡萄酒生產商為了使其產品在市場上有競爭力，希望得到發酵性能更優異的葡萄酒酵母菌株。例如：增加活性干酵母的抗脅迫能力和恢復能力，改善酵母對葡萄汁中糖分和氮素的吸收與同化，提高酵母對乙醇、其它微生物的代謝產物及毒素的耐受力，提高它們對亞硫酸鹽、重金屬和農業化學殘留物的耐受力，減少發酵過程中泡沫的形成，借助抗菌酶和多肽的表達或二氧化硫的代謝生產以實現對有害微生物的控制等。消費者對葡萄酒品質要求也在不斷提高，口味日趨多樣化，傾向于新型、健康的葡萄酒。例如：要求增加葡萄酒中有益于健康的物質如白藜蘆醇和水楊酸等，以及涉及葡萄酒風味的物質如酯類和醇類等的含量；減少葡萄酒中的酒精含量以及可能存在的微量有害物質如被懷疑有致癌可能的氨基甲酸乙酯和神經毒素生物胺等［12-13］。葡萄酒廠和消費者的這些需求直接推動了葡萄酒酵母的篩選和改良。

傳統的自然篩選、采用理化因素的誘變等經典的育種手段仍是目前最實用的常規技術，隨著現代科技的發展，出現了很多選育酵母的新技術如基因重組、基因工程育種等手段。

3.1 酵母的基因重組

采用雜交、接合、轉化和轉導等遺傳學方法，把兩個不同形狀個體內的基因放在一起，經遺傳交換（crossing over），重新組合后，使外源目的基因進入酵母細胞，并得以表達，以期使得酵母細胞在原有性狀的基礎上，獲得人們所需要的特殊性狀。基因重組技術是菌種改良的重要手段。

3.1.1 雜交育種 雜交育種利用了酵母的生活史、不同遺傳特性和相反交配型的細胞產生的雙倍體等特點。這種育種方式可以消除菌株在經歷長期誘變后所出現的產量性狀難以繼續提高的障礙。如利用選自乳清的釀酒酵母與葡萄汁酵母為親本進行雜交，可以在獲得雜合子的同時又具有兩個親本的優良性狀（分解蘋果酸能力強和生成乙酸能力弱）［14］。

3.1.2 細胞融合育種 細胞融合育種是將兩種不同的菌株經酶法去壁后，得到的原生質體，置于高滲溶液中，在融合劑的作用下產生細胞之間的融合，進而導致基因重組，獲得融合了親本優良性能的新菌株的育種方法［15］。陳海昌等［16］用啤酒酵母和糖化酵母進行原生質體融合，篩選出融株，既有較高的發酵度和絮凝性，又能水解淀粉和糊精，適宜生產低糖啤酒。微生物細胞融合技術是通過改變微生物細胞的遺傳性進行育種。高年發等［17］采用賴氨酸缺陷型釀酒酵母原生質與肌醇缺陷型粟酒裂殖酵母原生質體融合選育了葡萄酒發酵性能良好且具有降解蘋果酸能力的酵母菌株。它不受親緣關系影響，可克服細胞壁的天然屏障，遺傳信息傳遞量大，不需了解雙親詳細的遺傳背景，便于操作，而且原生質體的再生過程本身也可以認為是篩選的過程。所以可以在種內、屬內、屬間甚至跨界進行，并且在各個領域中都取得了一定的效果。

值得一提的是跨界融合技術，其作為細胞融合技術的一個擴展領域，具有很大的前景和挑戰性。然而由于跨界融合的親緣關系甚遠，融合難度大，篩選困難，且融合后代遺傳穩定性差等原因［18］，因此跨界融合成功的事例并不多見。期待將來利用酵母的天然優良品質，打破種屬間界線，應用跨界融合技術，為葡萄酒釀造研發出更佳的酵母菌株。

3.1.3 Genome shuffling技術 Genome shuffling技術是在傳統誘變基礎上，通過多輪遞推細胞融合技術的方式，使誘變后的酵母細胞進行基因組重組，進而提高酵母細胞的正向突變頻率及正向突變速度，最終從獲得的突變體庫中篩選出所需要的酵母菌株。Genome shuffling技術在只了解微生物遺傳性狀的基礎上實現了微生物的定向育種，獲得了大幅度正突變的菌株，也成為微生物發酵工程中的一種有效的工具。陸筑鳳等［19］采用了紫外誘變和 Genome shuffling技術相結合的方法篩選得到既耐高溫又耐乙醇的酵母菌，選育出高溫下能高產乙醇和香味物質的釀酒酵母。

3.2 基因工程育種

基因工程育種是從生物體內提取出所要表達的基因或人工合成的DNA片段，導入適當的載體，再轉人釀酒酵母細胞中，使遺傳物質重新組合，從而實現對釀酒酵母的改良。自從1996年釀酒酵母全基因組測序工作的完成，人們對葡萄酒酵母的復雜代謝過程有了越來越多的認識。迄今為止，科學家們已為葡萄酒酵母發展了多種有效的質粒載體和基因轉移方法，以及用于外源基因在酵母體內表達和產物分泌的表達和分泌盒。上述葡萄酒酵母基因組學和分子生物學的研究成果，以及近些年生物信息學的迅速發展為新型酵母菌株的基因設計和選擇提供了更廣的適用性和更強的專一性手段，使葡萄酒酵母的分子改良取得了許多進展，例如：過量生產甘油［20］、降低酒精的含量、增加酚類化合物的釋放、減少乙烷基氨基甲酸鹽的生成［21］、增加葡萄抗氧化劑白藜蘆醇的生成［22］和酯類物質的生成等。

根據目的基因的來源和所構建的酵母基因工程菌是否含有外源DNA片段，可以將酵母菌的遺傳修飾分為非自身克隆和自身克隆兩種技術。通過自身克隆技術構建的酵母基因工程菌中，不但目的基因來源于酵母菌本身，而且不引入任何其他的外源DNA片段，所以這種酵母基因工程菌更容易被企業和消費者接受和應用到生產實踐中。近來，這項技術已被應用于葡萄酒酵母菌株的改良。Coulon J等通過把DUR1，2基因置于PGK1啟動子的控制之下，獲得了減少產生致癌物氨基甲酸乙酯的菌株［21］。隨著分子生物學和分子遺傳學的發展，利用基因工程技術將會定向地對釀酒酵母進行改造與構建，從而獲得具有更加優良釀造特性的葡萄酒酵母。

此外，關于菌種選育的其它方法如離子束注入、激光誘變、高壓靜電等方法的應用，也展現了新的前景。

4 結語

葡萄酒因具有很高的營養和保健作用而越來越受到人們的青睞，人們對葡萄酒的消費越來越注重品質。生產廠家為了在競爭日趨激烈的葡萄酒市場中立于不敗之地，也需要想盡一切辦法來降低生產成本和提高葡萄酒的品質。生物技術在二十一世紀為提高葡萄酒的品質，降低優質葡萄酒的生產成本，滿足不同消費者多元化的個性需求，提供了更為廣闊的可能和選擇空間。葡萄酒酵母是葡萄酒品質的靈魂，對葡萄酒產量、色澤、香氣、感官質量和風格的影響非常重要，用不同菌種發酵生產的葡萄酒，其產量、酒質和風味大不相同。因此應用現代科技手段調控葡萄酒發酵工藝和選育優良酵母菌種是目前葡萄酒研究領域的熱點之一。在基因技術應用方面，對消費者和生產者同樣都有著巨大的潛在效益。葡萄酒行業的趨勢可能會根據消費者的喜好訂制菌株，這樣大量的葡萄酒必將開辟適合特殊消費者群體的特殊市場。盡管很多經基因改良的酵母由于生物安全性不能保證而無法應用到工業生產上，但隨著具備較高生物安全性的自克隆技術的發展，相信在不遠的將來會有越來越多的基因改良的葡萄酒酵母菌株應用到葡萄酒釀造過程之中。

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Wine brewing and the improvement of wine yeast species

WANG Xiao-fei，WU Xiao-yu，KONG Ling-bao*
（Key Laboratory of Fermentation Applied Technology，College of Biological Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

Saccharomyces cerevisiae is an important industrial micro-organism，which is the soul of the wine quality.ln anaerobic conditions，Saccharomyces cerevisiae has played a crucial role in the process from grape to wine.The relationship of wine yeast and wine brewing was described.And the manipulation methods occurred in wine industrialization fermentation process，the current application of modern scientific and technological means to breed wine yeast species were also introduced.Finally，the current situation and future prospects for the wine brewing industry was discussed and viewed.

yeast；wine；DNA microarray technology；LONWORKS technology；strain breeding

TS262.6

A

1002-0306（2010）11-0420-04

2009-09-07 *通訊聯系人

王曉飛（1983-），女，碩士研究生，主要從事微生物次級代謝產物方向的研究。