非組培遺傳轉(zhuǎn)化法在農(nóng)作物上的應(yīng)用

任海紅，任小俊，王 英，劉學(xué)義

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，山西汾陽032200；2.汾陽中學(xué)，山西汾陽032200）

自1983年第1例轉(zhuǎn)基因植株成功獲得以來，植物基因工程研究進入了蓬勃發(fā)展時期。轉(zhuǎn)化技術(shù)方法已發(fā)展到20種左右，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、基因槍法、電擊法、PEG法、顯微注射法等，其中最理想的技術(shù)仍是農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，主要的目的是培育抗病蟲、抗除草劑、抗旱、耐鹽堿的優(yōu)質(zhì)農(nóng)作物新品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)突破了物種的界限，可以將動物、微生物的有益基因轉(zhuǎn)化到植物中。目前，已有一系列轉(zhuǎn)基因作物品種形成，如抗蟲棉、抗蟲玉米、抗蟲水稻、抗除草劑大豆、抗白葉枯病水稻等。植物基因工程技術(shù)在農(nóng)作物品種改良和育種方面發(fā)揮著越來越重要的作用。

目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化所采用的受體系統(tǒng)，大都依賴于細胞組織培養(yǎng)技術(shù)才能獲得轉(zhuǎn)基因植株。但由于組培周期長并存在一定的局限性，因而近年來發(fā)展起來一些非組培的轉(zhuǎn)化方法。本文著重對幾種非組培轉(zhuǎn)化方法的技術(shù)原理及其在農(nóng)作物上的應(yīng)用進行了介紹，并對今后的發(fā)展方向進行了展望。

1 幾種非組培轉(zhuǎn)化方法的原理及其應(yīng)用

1.1 真空滲透法

真空滲透法是一種原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化方法。1993年，Bechtold等首先在擬南芥的轉(zhuǎn)化中獲得成功。該方法主要步驟為:在開花早期將擬南芥花浸入含農(nóng)桿菌菌液的液體培養(yǎng)基中，然后用真空泵抽真空處理，再恢復(fù)常壓，使農(nóng)桿菌菌液滲入到植物組織內(nèi)部。真空處理之后植株處于一種極度衰弱的狀態(tài)，需平放于高濕環(huán)境中進行恢復(fù)性生長，然后轉(zhuǎn)栽于正常生長條件下，收獲種子，篩選、檢測轉(zhuǎn)基因植株。

Bechtold等建立了整株（in planta）原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化方法，此后許多學(xué)者在擬南芥[1]和蕓薹屬的一些作物[2]上進行了大膽嘗試。李曉等[3]以棉花花粉作為受體細胞，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下將外源基因?qū)牖ǚ壑校缓笸ㄟ^人工授粉獲得轉(zhuǎn)化。它避開了傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化方法所需的組培過程，含外源基因的花粉可與卵細胞自然結(jié)合，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體不存在轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細胞間的嵌合現(xiàn)象。

真空滲透法轉(zhuǎn)化植物不需經(jīng)過組織培養(yǎng)即可直接獲得轉(zhuǎn)化的種子，易于重復(fù)，可靠性高。目前，真空滲透法在擬南芥、白菜、油菜等的遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用較多[4-5]。實驗中，植物發(fā)育階段、抽真空的強度和時間、農(nóng)桿菌的濃度對轉(zhuǎn)化效率都有影響。

1.2 Floral-dip法

Floral-dip法是在擬南芥真空滲透法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。在植株的花蕾期，將花序浸漬在含有表面活性劑的工程農(nóng)桿菌菌液中，經(jīng)表面活性劑的吸附和滲透作用，強化和刺激細胞的轉(zhuǎn)化。

Clough等[6]首先在擬南芥中用浸蘸法轉(zhuǎn)化獲得成功。后來，Chung等[7]對擬南芥花序進行了農(nóng)桿菌菌液直接噴霧（floral-spray）處理，同樣獲得了轉(zhuǎn)化株，這是比Floral-dip法更為簡便的轉(zhuǎn)基因方法。在作物方面，劉琦[8]用此方法將CYCD2基因?qū)胄←溨校M行了有意義的嘗試。暢乃迪[9]嘗試采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Floral-dip轉(zhuǎn)化法，在大田中首次對玉米雄花進行遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得了成功。王翠艷等[10]首次運用Floral-dip法將植酸酶基因轉(zhuǎn)入冀豆12，獲得遺傳轉(zhuǎn)化率為1.18%～2.22%。雖然此方法在作物方面的應(yīng)用并不是很成熟，但這些大膽的嘗試對擴展該方法的應(yīng)用領(lǐng)域、簡便有效地提高作物的遺傳轉(zhuǎn)化效率奠定了一定的基礎(chǔ)。

1.3 花粉管通道法

花粉管通道法是一種建立在不依賴于植物細胞組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，是周光宇等[11]在20世紀80年代建立的。該技術(shù)利用開花植物授粉后形成花粉管通道，使得外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進入胚囊，直接將外源DNA導(dǎo)入尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞中，從而實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移。該方法可用于任何開花植物。據(jù)操作方式的不同，它通常有2種方法，即子房注射法和柱頭滴注法。

子房注射法是指使用顯微注射儀把外源DNA溶液注入到子房中，由于子房產(chǎn)生的高壓力及卵細胞的吸收，使外源基因進入受精的卵細胞。劉博林等[12]采用合子期子房微注射法，將龍葵Atrazine抗性基因psbA導(dǎo)入對Atrazine敏感的大豆葉綠體基因組中，經(jīng)直接用Atrazine涂抹葉片及葉片在較強光誘導(dǎo)下熒光動力學(xué)研究和間接分子雜交試驗等檢測方法鑒定，獲得了轉(zhuǎn)基因大豆植株。張國棟等[13]將玉米自交系和大豆品種東農(nóng)36的DNA分別導(dǎo)入另一大豆品種中，其后代的突變率分別為10%和5.32%，出現(xiàn)了種子蛋白含量、株高、莖粗、結(jié)莢習(xí)性、倒伏性、每株分枝數(shù)與莢數(shù)、粒數(shù)與百粒質(zhì)量等性狀變異。余桂榮等[14]選擇開花后0.5～2.0 h的小麥作受體進行轉(zhuǎn)化，獲得較高的結(jié)實率和轉(zhuǎn)化率。李余良等[15]用子房注射法將Bt抗蟲基因?qū)氤鹩衩灼贩N粵甜3號，獲得了1株整合有Bt基因的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為9.09%。李遠新等[16]以黃瓜品種津研4號為受體，以質(zhì)粒pBI121為供體，建立起高效的黃瓜子房注射轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，試驗表明，黃瓜授粉后12 h注入外源基因的轉(zhuǎn)化率最高。魏愛民等[17]也用子房注射法得到抗蟲轉(zhuǎn)基因苗。田間子房注射轉(zhuǎn)化法主要用于子房較大的作物，如棉花、玉米、瓜類。由于該方法轉(zhuǎn)化偶然性比較大，因此，成功的關(guān)鍵是注射時間及注射位置和深度的把握。

柱頭滴注法是先將正在大量授粉的花柱柱頭切去，然后滴入DNA（DNA的濃度要大于子房注射法）。周春江等[18]利用柱頭滴注法將兔防御素NP-1基因?qū)胄←溨校?jīng)田間抗病蟲鑒定，這些植株對于白粉病、葉銹病和條銹病有較強的免疫力和抗性。王永芳等[19]采用柱頭滴注法將谷子的抗逆相關(guān)基因DNAj轉(zhuǎn)入小麥中，獲得了成功，為創(chuàng)造抗逆性改良的小麥新材料奠定了基礎(chǔ)。在大豆方面，雷勃鈞等[20]將半野生大豆的總DNA導(dǎo)入到栽培大豆中，育成我國第1個利用花粉管通道法獲得的大豆品種黑生101。2006年，劉德璞等[21]以吉林20號、吉林30號、吉林45號為供試材料，通過花粉管通道法，將雪花蓮凝集素GNA基因進行轉(zhuǎn)化，通過接蚜鑒定和PCR檢測，從中篩選出轉(zhuǎn)基因植株，后代分離符合孟德爾規(guī)律，轉(zhuǎn)化率約為1%。劉建鳳[22]在花粉管通道法的基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化了大豆柱頭滴注法。其具體做法為：選取大豆自花授粉6～8 h后的完全開放的花朵，首先用鑷子去除同一節(jié)上不符合要求的花，然后將符合要求的花用鑷子夾去花瓣，接著用剪刀完全剪去花柱，將6 μL轉(zhuǎn)化溶液滴加在子房傷口處，如氣溫較高，補滴1次，轉(zhuǎn)化率可達3.18%。趙寶存等[23]在小麥授粉后2～4 h，用剪刀剪去柱頭的1/3，將T型細胞質(zhì)雄性不育保持系75-23369B線粒體的基因文庫的不同重組子DNA滴在斷面上。結(jié)果顯示，重組子ME252和ME317的轉(zhuǎn)化后代變成可育。張森燕等[24]將構(gòu)建好的ZmPti1基因的正義表達載體和RNAi載體，通過柱頭滴注法分別轉(zhuǎn)化到玉米自交系178中。經(jīng)檢測分別得到15株和18株轉(zhuǎn)基因植株。此法適用于較小花器的作物。

實際操作中，作物所采用的轉(zhuǎn)化方式，注入DNA溶液的量均根據(jù)子房的大小而定。除了應(yīng)考慮導(dǎo)入方式對花器（子房、柱頭）傷害最小外，導(dǎo)入時間和時期的選擇也至關(guān)重要。對于有些植物開花授粉時間不易控制的，可以先進行人工授粉，再在一定的時間梯度內(nèi)進行轉(zhuǎn)化處理。

1.4 胚性組織浸染轉(zhuǎn)化法

近年來發(fā)展起來一種浸染轉(zhuǎn)化法，不同的研究單位方法不同。其原理是根據(jù)種子的發(fā)芽生理，將外源DNA隨著種子或幼胚的萌發(fā)或生長，進入種胚細胞，在當代就能表現(xiàn)出變異，并得到遺傳。

Rohini等[25]將種子中的一個子葉去掉，把帶有胚軸的另一片子葉萌發(fā)后用無菌針在胚軸處輕輕劃幾下，在農(nóng)桿菌中浸泡幾分鐘，然后共培養(yǎng)、漂洗，子葉繼續(xù)萌發(fā)、生苗，收獲種子進行轉(zhuǎn)基因后代的檢測。Rohini等[26]用該方法在花生上獲得成功，轉(zhuǎn)化效率達3.3%～5.3%。王成杰[27]初步建立了利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥萌芽種子的方法，并證明外源基因已轉(zhuǎn)移到植物細胞中。山西省農(nóng)科院孫毅等發(fā)明了以萌動胚為受體的轉(zhuǎn)化方法，梁雪蓮等[28]用此方法與花粉介導(dǎo)、子房注射法在玉米上轉(zhuǎn)化bar基因，從轉(zhuǎn)化率與操作簡便程度上進行比較，認為花粉介導(dǎo)優(yōu)于萌動種胚法，且二者又優(yōu)于子房注射法。王昌濤等[29]成功地建立了一個農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系，具體做法為：把劃好的玉米萌動胚放入YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min振蕩24 h，然后把種子放在MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)入帶有潮霉素的篩選培養(yǎng)基中7～10 d，經(jīng)過篩選后的幼苗移栽到溫室中。

胚性組織浸染轉(zhuǎn)化法克服了組織培養(yǎng)再生難、轉(zhuǎn)化率低的缺點，不需要高昂的儀器設(shè)備，是高頻、簡單、快捷的非組培遺傳轉(zhuǎn)化途徑，便于一般科研院所推廣應(yīng)用。但該技術(shù)還需要在實踐中不斷完善。

2 問題及展望

本文所述的植物非組培轉(zhuǎn)化方法具有簡便、快捷、無需組培等優(yōu)點，但這些方法有的還處于嘗試階段，在作物上應(yīng)用還不成熟，轉(zhuǎn)化效率還很低，不能滿足作物育種和功能基因研究的需要。因此，對非組培轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化過程中的影響因素仍需進一步研究。目前，花粉管通道法相對成熟，且易于實現(xiàn)大規(guī)模基因轉(zhuǎn)化，是一種很有潛力的作物遺傳轉(zhuǎn)化方法。目前，花粉管通道法在我國已成為與農(nóng)作物育種應(yīng)用結(jié)合最為密切的技術(shù)，是安全高效的分子育種途徑，是生物技術(shù)育種中的一個重要研究領(lǐng)域。

隨著分子生物學(xué)和植物基因工程的不斷發(fā)展，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為手段的植物遺傳改良成為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種的重要途徑。而轉(zhuǎn)基因作物的安全性越來越受到人們的重視，其中，篩選標記基因和載體骨架序列是影響轉(zhuǎn)基因作物安全性評價的重要因素。基因槍和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法目前均較難實現(xiàn)無載體骨架序列無選擇標記基因的轉(zhuǎn)化，而花粉管通道法等非組培方法可以解決該問題。因此，隨著非組培轉(zhuǎn)化方法的改進、轉(zhuǎn)化效率的提高，植物非組培轉(zhuǎn)化方法將為作物分子育種和基因功能研究提供有力的方法保障。

［1］ Cecchine E，Gong Z H，Geri C，et al.Transgenic Arabidopsis lines expressing gene VI from cauliflower mosaic virus variants exhibit arange of symptom-like phenotype and accumulate inclulate inclusion bodies[J].Mol Plant Microbe Interactions，1997，10（9）：1094-1101.

［2］Cao M Q，Liu F，Yao L，et al.Transformation of pakchoi（Brassica rapa L ssp chinensis）By Agrobacteriun infiltration[J].Mol Breeding，2002（6）：67-72.

［3］ 李曉，王學(xué)德，朱玉賢，等.農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化花粉獲得棉花轉(zhuǎn) acsB 基因植株 [J].作物學(xué)報，2002，28（5）：709-712.

［4］鞏振輝，Milner J J，何玉科.擬南芥基因轉(zhuǎn)移新方法——真空滲入法的研究[J].西北植物學(xué)報，1996，16（3）：277-283.

［5］ 曹傳增，劉凡，趙泓，等.影響不結(jié)球白菜真空滲入轉(zhuǎn)基因頻率的幾個因素[J].華北農(nóng)學(xué)報，2003，18（4）：35-38.

［6］ Clough S J，Bent A F.Floral dip:a simple method for A-graobacterium-meidated transformation ofArabidopsis thaliana[J].The Plant Journal，1998，16（6）：735-743.

［7］ Chung M H，Chen M K，Pan S M.Floral-spray transformation can efficiently generate Arabidopsis Transgenic Plants[J].Transgenic Res，2000，9（6）：471-476.

［8］ 劉琦.基因槍法和農(nóng)桿菌-花器浸蘸法將CYCD2基因?qū)胄←湹难芯縖D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［9］ 暢乃迪.Floral-dip轉(zhuǎn)化優(yōu)良玉米自交系初探 [D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［10］ 王翠艷，丁東風(fēng)，于曉菊，等.Floral-dip法在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究 [J].南開大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，43（1）：34-43.

［11］ 周光宇，翁堅，龔蓁蓁.授粉后外源DNA導(dǎo)入植物的技術(shù)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1988，21（3）：12-61.

［12］ 劉博林，岳紹先，胡乃壁，等.龍葵抗性基因向大豆葉綠體的轉(zhuǎn)移及在轉(zhuǎn)基因植株中的表達 [J].中國科學(xué)，1989，19（7）：699-705.

［13］ 張國棟，趙長山.將外源DNA注入幼莢實現(xiàn)大豆遺傳轉(zhuǎn)化[J].大豆科學(xué)，1994，13（3）：268-273.

［14］ 余桂榮，尹鈞，任江萍，等.小麥花粉管通道法轉(zhuǎn)基因研究[J].麥類作物學(xué)報，2004，24（2）：15-19.

［15］ 李余良，胡建廣，蘇菁，等.子房注射法將Bt基因?qū)氤鹩衩譡J].玉米科學(xué)，2005，13（1）：41-43.

［16］ 李遠新，王關(guān)林，葛曉光.黃瓜授粉后外源基因直接導(dǎo)入技術(shù)研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2000，15（2）：89-94.

［17］ 魏愛民，張文珠，杜勝利，等.黃瓜花粉管通道法抗蟲基因?qū)爰翱敲顾乜剐院Y選 [J].華北農(nóng)學(xué)報，2008，23（6）：54-57.

［18］ 周春江，葛榮朝，趙寶存，等.利用花粉管通道法將兔防御素NP-1基因?qū)胄←湹难芯?[J].華北農(nóng)學(xué)報，2007，22（2）：26-28.

［19］ 王永芳，張軍，崔潤麗，等.利用花粉管通道轉(zhuǎn)化谷子DNAj基因獲得轉(zhuǎn)基因小麥[J].華北農(nóng)學(xué)報，2009，24（2）：17-21.

［20］ 雷勃鈞，錢華，李希臣，等.通過直接引入外源DNA育成高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高蛋白大豆新品種黑生101[J].作物學(xué)報，2000，26（6）：725-730.

［21］ 劉德璞，袁鷹，唐克軒，等.大豆花粉管通道技術(shù)轉(zhuǎn)化雪花蓮凝集素（GNA） 基因 [J].分子植物育種，2006，4（5）：663-669.

［22］ 劉建鳳.大豆子房滴注轉(zhuǎn)化方法的研究及耐鹽基因（AINHX1）的轉(zhuǎn)化[D].大連：大連理工大學(xué)，2009.

［23］ 趙寶存，葛榮朝，沈銀柱，等.小麥T型細胞質(zhì)雄性不育保持系線粒體DNA片段轉(zhuǎn)化不育系的初步研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2004，19（4）：21-23.

［24］ 張森燕，吳忠義，張秀海，等.ZmPti1基因正義和RNAi表達載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化玉米的研究 [J].華北農(nóng)學(xué)報，2008，23（5）：1-5.

［25］ Rohini V K，Sankara R K.Embryo transformation，a practical approach ofrealizingtransgenic plants of safflower（Carthamus tinctorius L）[J].Annl Bot，2000，86：1043-1049.

［26］ Rohini V K，Sankara R K.Transformation of peanut（Arachis hypogaea L）：a non-tissue culture based approach for generatingtransgenic plants[J].Plant Sci，2000，130：41-49.

［27］ 王成杰.農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥非組培轉(zhuǎn)化方法的探討 [D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［28］ 梁雪蓮，郭平毅，孫毅，等.玉米3種非組培轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化外源 bar 基因研究 [J].作物 學(xué)報，2005，31（12）：1648-1653.

［29］ 王昌濤，趙玉錦，李坤遠，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系的建立[J].華北農(nóng)學(xué)報，2007，22（5）：110-113.