EOLA1基因在 DA大鼠移植肝臟急性排斥反應中表達的初步研究*

冉崇福,竇科峰,劉少山,鄭仲謹,梁自文,劉永康

(1.解放軍第四五二醫院肝膽科,四川 成都 610021;2.第四軍醫大學西京醫院肝膽科,陜西 西安 710032;3.第三軍醫大學西南醫院,重慶 400038)

近年梁自文等[1-3]在研究燒傷、創傷后炎癥反應狀態時,發現一種人內皮細胞活化新基因 EOLA1,并顯示出 EOLA1參與了炎癥反應過程,在富血管組織有高表達。我們前期研究發現,EOLA1在人類肝臟組織也有較高表達,參與了血管的修復和炎癥時細胞的自我保護反應[3]。肝臟移植急性排斥反應最常見的是表現為免疫排異引起的肝內嚴重炎癥反應,新基因 EOLA1是否參與了急性免疫排斥所引起的肝內嚴重炎癥反應過程、起著什么樣的作用還不清楚,為此,本實驗通過建立近交系大鼠同種異體原位肝移植急性排斥反應模型(DA→Lewis),對新基因 EOLA1在 DA大鼠移植肝臟急性排斥反應時的表達情況做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組:雄性近交系 DA大鼠 30只和 Lewis大鼠 90只,體重 200-220g,分別購自哈爾濱醫科大學動物中心、北京維通利華實驗動物有限公司。本研究分為 A、B兩組,A組 30例:Lewis→Lewis大鼠肝臟移植作為移植耐受組做對照;B組30例:DA→Lewis大鼠肝臟移植急性排斥反應模型。

1.2 實驗藥品及器材:凝膠回收試劑盒,Promega公司;PCR回收試劑盒,Roche公司;RT-PCR試劑盒,TaKaRa公司;全自動生化分析儀(Becman公司,CX-7);Du-640紫外分光光度計,美國 Beckman;PCR儀 ,美國 M.J.。

1.3 實驗方法

1.3.1 移植模型建立:大鼠肝臟移植模型的建立按照改良“二袖套”法完成[4]。A組:移植耐受組(n=30),選用 Lewis大鼠 60只,30只為供體,30只為受體,建立 30例肝臟移植耐受模型;B組:急性排斥組(n=30),選用 DA大鼠 30只為供體,Lewis大鼠 30只為受體,建立 30例肝臟移植急性排斥模型。

1.3.2 檢測指標及方法:①大鼠原位肝移植術后的生存時限,每組 5只觀察移植術后平均存活天數。②肝功能檢查 分別于術后 1、3、5、7、10天處死大鼠,經腹主動脈抽血2 ml離心后取上層血清測ALT、TBIL。 ③病理學檢查 分別于術后 1、3、5、7、10天處死大鼠,取部分新鮮肝組織,福爾馬林固定 24小時,常規石蠟包埋、切片、蘇木素 -伊紅(HE)染色后鏡檢。④移植肝組織 EOLA1基因的表達 Western blot檢測移植肝組織 EOLA1的表達,每組于術后 1、3、5、7、10天處死大鼠,取部分新鮮肝組織液氮保存。提取總蛋白,以變性總蛋白進行 Western blot檢測,每次電泳均包含各組,一抗為前期制備的抗EOLA1多抗[5],二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG工作液,檢測術后 1、3、5、7、10天 5個時間點的 EOLA1水平。用 ECL系統軟件半定量分析,計算各組平均值。

1.4 統計學處理:所有數據分析均通過 SPSS 10.0進行。計量數據以 (x-±s)表示,組內與組間樣本均數兩兩比較采用 t檢驗,p＜0.05為差異顯著,p＜0.01為差異非常顯著。

2 結 果

2.1 大鼠肝移植術后一般情況的觀察:大鼠肝移植60例次,平均手術時間 90分鐘,無肝期(14.0±2.5)秒。手術死亡 1例,術后肝上下腔靜脈出血 1例,門靜脈出血 1例。A組平均生存時間超過 100天,B組平均存活時間(16.2±1.4)天;兩組比較相差非常顯著(p＜0.01)。

2.2 肝功能檢查:A組大鼠肝移植術后第 1天ALT、TBIL有輕度增高,至第 3天降至正常。B組第1天開始 ALT、TBIL逐漸升高,第 10天達到高峰,兩組比較相差非常顯著(p＜0.01)。

2.3 移植肝組織 EOLA 1的表達:術后 1、3、5、7、10天 5個時間點的 EOLA1水平,A組移植肝組織 EOLA1表達高,B組較低(見圖 1);A、B兩組術后 5個時間點 EOLA1表達的灰度值比較,相差非常顯著(見圖2 p＜0.01)。

2.4 病理學檢查:A組未見明顯的病理損害;B組術后第 5天開始出現匯管區炎細胞浸潤,第 10天明顯加重,可見匯管區及中央靜脈周圍大量的單核淋巴細胞浸潤,肝細胞壞死,出現靜脈內皮炎和膽管上皮炎,膽管上皮細胞可出現變性、壞死及脫落,甚至可見炎性浸潤擴展至肝實質。

3 討 論

近交系大鼠 DA→LEW是國際上比較公認的肝移植急性排斥動物模型,具有研究周期短、模型穩定、病理改變典型、可重復性好的優點,因此本實驗在 Kamada建立的“雙袖套”法的基礎上,改良建立實驗模型[4]。實驗結果表明:耐受組移植術后血清ALT和TBIL以及移植肝臟組織病理基本正常,無明顯的排斥反應;排斥反應組術后第 5天血清 ALT和TBIL開始出現升高、第 10天達到高峰,移植肝臟組織病理第 5天出現匯管區炎癥細胞浸潤、且隨著時間而加重,第 10天匯管區更加嚴重出現明顯的血管內皮炎和膽管上皮炎、炎細胞侵犯到肝實質、肝細胞片狀壞死,參照人排斥反應的 Banff標準,符合急性排斥反應診斷標準,能滿足本實驗的要求[4,6]。

本實驗大鼠肝移植術后 EOLA 1的表達耐受組與急性排斥組相差非常顯著,從術后 5個時間點的變化趨勢分析,急性排斥組大鼠移植肝臟組織隨著時間的延長,免疫排斥反應越嚴重、移植肝臟組織炎性反應和組織壞死越明顯,但 EOLA1的表達水平相比耐受組低下,EOLA1表達水平的高低與移植肝組織內急性排斥反應的嚴重程度存在一定程度的負相關,即排斥反應越重 EOLA1的表達越低。

EOLA 1是人內皮活化相關新基因,前期研究發現 EOLA1與細胞內抗金屬硫蛋白 2A(metallothio-nein 2A,MT2A)發生相互作用,而 MT2A廣泛分布于各組織細胞,具有多種重要的生理功能,主要參與金屬代謝、對抗內毒素脂多糖(LPS)、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等。EOLA 1與 MT2A相互作用參與了對細胞生長的影響,因為當在細胞內穩定高表達 EOLA1后,細胞增殖明顯加強,但是,在炎癥刺激時,內皮細胞表達 EOLA1增高,與胞內蛋白 MT2A發生相互作用,這種作用信號進一步轉導到核內,調控相關基因的表達,促進了細胞的生長,有助于血管的修復和炎癥時細胞的自我保護反應[1,2,3,7]。

新基因 EOLA1在體內系統性炎癥反應中具有保護調節作用[7],結合本實驗結果,我們推測 EOLA1在肝臟組織中也可能發揮了抗排斥和保護肝內血管內皮細胞以及移植肝細胞的作用。

[1] Ziwen L,ZongchengY.Identification and characterization a novel gene EOLA1 stimulating ECV304 cell proliferation[J].Biochem Biophysic Res Comun,2004,325(22):798-802

[2] 梁自文,楊宗城,羅向東,等.人內皮細胞活化相關新基因 EOLA 1的發現及初步研究[J].解放軍醫學雜志,2003,28(5):422-424

[3] 梁自文,楊宗城,羅向東,等.內皮細胞活化相關新基因 EOLA 1的亞細胞定位及組織表達[J].解放軍醫學雜志,2004,29(4):342-344

[4] 冉崇福,竇科峰,劉永康,等.DA→LEW大鼠肝臟急性排斥反應模型的技術改進與評價[J].西南國防醫藥,2007,17(3):278-280

[5] 梁自文,王清良,楊宗城,等.EOLA 1抗體的制備及腫瘤組織中EOLA 1的表達檢測[J].第三軍醫大學學報,2009,31(24):2418-2420

[6] 浦立勇,姚愛華,李相成,等.DA到 Lewis大鼠肝臟移植急性排斥模型的建立[J].第四軍醫大學學報,2006,27(12):1071-1073

[7] 梁自文,楊宗城,劉明月,等.刺激 ECV 304細胞增殖的新基因EOLA 1的克隆與功能研究[J].中華醫學遺傳學雜志,2005,22(5):518-523